李 謙，胡 富，寧利敏，朱本偉，倪 芳，姚 忠

(1.南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學 食品與輕工學院，江蘇 南京 211800；3.南京中醫(yī)藥大學 醫(yī)學與生命科學學院，江蘇 南京 210023)

褐藻膠主要是由褐藻以及細菌產(chǎn)生的一種酸性多糖，是褐藻門植物如海帶(Saccharinajaponica)、裙帶菜(Undariapinnatifida)等細胞壁的主要成分[1]。褐藻膠主要由兩個單體組成，β-D-甘露糖醛酸(M)以及它的C5差向異構(gòu)體，α-L-古羅糖醛酸(G)。各個單體之間通過1,4-糖苷鍵相連，可以形成均聚甘露糖醛酸片段(polyM)、均聚古羅糖醛酸片段(polyG)以及兩個單體交替連接形成雜合片段(polyMG)[2]。褐藻膠具有多種生物活性，廣泛應用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)，但是由于其具有分子量大、水溶性差及生物利用度低的缺點，極大地限制了其在生物醫(yī)藥領域的應用[3]?？梢圆捎妹附獾姆椒▽⑵浣到鉃楹衷迥z寡糖，褐藻膠寡糖保持了多糖所具有的抗腫瘤、促進生長、調(diào)節(jié)免疫等功效，更是由于水溶性好和生物利用度高，受到了國內(nèi)外研究者的關注[4]。

褐藻膠裂解酶屬于多糖裂解酶家族，通過β消除來降解褐藻膠。褐藻膠裂解酶的來源主要有①海洋細菌、土壤細菌、噬菌體以及真菌等微生物；②海洋藻類；③海洋棘皮動物以及軟體動物[5]。目前對褐藻膠裂解酶的分類方法大致有以下幾種方式：根據(jù)酶的作用方式來分可以分為內(nèi)切型和外切型的酶[6-7]；根據(jù)氨基酸序列來分，褐藻膠裂解酶分屬到7個多糖裂解酶家族(polysaccharide lyase family)，即PL5、PL6、PL7、PL14、PL15、PL17，PL18；根據(jù)底物特異性來分，可分為polyM特異性裂解酶、polyG特異性裂解酶和可降解polyM和polyG的雙功能裂解酶[5]。從結(jié)構(gòu)上來看，褐藻膠裂解酶主要可以分為3類：①β果凍卷，PL7、PL14，PL18家族的酶多為這種結(jié)構(gòu)；②(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)，PL5、PL15、PL17家族的酶多為這種結(jié)構(gòu)；③β螺旋，PL6家族的酶多為這種結(jié)構(gòu)[8]。

褐藻膠裂解酶通過β消除的方式降解褐藻膠，其具體的催化機制可以分為組氨酸(Tyr)/Tyrβ消除、金屬離子輔助β消除。本文中，筆者主要綜述目前褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)分類以及催化機制的研究進展。

1 褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)

1.1 β果凍卷(β jelly roll)

β果凍卷結(jié)構(gòu)中主要含有兩條反向平行的β折疊片，如圖1所示，內(nèi)凹片段SA(Sheet A)和外凹片段SB(Sheet B)，這兩條β折疊片從中間彎曲近90度并且由多條環(huán)所連接，從而使得整個結(jié)構(gòu)呈球形。SA片段形成的裂縫中含催化活性位點，褐藻膠通過裂縫進入其中，與活性位點的氨基酸殘基相互作用，由此可推斷SA片段中保守的氨基酸殘基對這一類酶的催化機制有著十分重要的影響。β果凍卷是褐藻膠裂解酶中最常見的折疊方式。目前，在已經(jīng)解析晶體結(jié)構(gòu)的褐藻膠裂解酶中，有13種褐藻膠裂解酶采用β果凍卷折疊，其中有9種來自PL7家族，2種來自PL14家族，2種來自PL18家族，如表1所示。

圖1 具有β果凍卷結(jié)構(gòu)的褐藻膠裂解酶的三維結(jié)構(gòu)

PL7家族的褐藻膠裂解酶多采用β果凍卷的結(jié)構(gòu)(圖1(a))，目前已經(jīng)表征的10種褐藻膠裂解酶中有9種來自其中，包括由PseudomonasaeruginosaPAO1產(chǎn)生的PA1167[9]、Klebsiellapneumoniae產(chǎn)生的AlyA、Corynebacteriumsp.ALY-1產(chǎn)生的alyPG[10]、Zobelliagalactanivorans產(chǎn)生的AlyA1和AlyA5[11]，以及由Sphingomonassp.A1產(chǎn)生的A1-II[12]，還有來源于Persicobactersp.CCB-QB2的AlyQ[13]、來源于Flavobacteriumsp.UMI-01的FlAlyA[14]及來源于VibriosplendidusOU02的AlyB[15]。

PA1167(PDB:1VAV)是該家族最早被表征的采用β果凍卷結(jié)構(gòu)的酶，它由3條短的α螺旋和兩條反向平行的β折疊片構(gòu)成。它的SA片段由8條β鏈、SB片段由7條β鏈構(gòu)成。該家族的A1-II’(PDB:2CWS)是目前研究較為透徹的酶，它包含2個反向平行的β折疊片和4個小α螺旋結(jié)構(gòu)。其中9條β鏈組成SA，7條β鏈組成SB片段。該酶的活性中心由Arg146、Gln189、His191和Tyr2844個氨基酸殘基組成，作為一種內(nèi)切型的酶，該酶的活性中心呈敞開狀。通過結(jié)構(gòu)解析，多數(shù)催化位點均處于SA上(如SA3、SA4和SA5)，其中位于SA3上的Arg59、Glu61和Arg63，與位于SA5上的Gln102、His104以及SA4上的Tyr193、Lys195、Gly197、Tyr199和Gln201均處于酶分子的表面，構(gòu)成了一個活性裂隙，在催化反應中起著重要的作用。同時，沿著折疊片結(jié)構(gòu)分布的一些高度保守的位點如Phe34、Ser60、Leu62、Phe194、Ala196和Leu218，這些處于催化活性中心周圍的氨基酸殘基與周圍的同源性殘基如Trp7、Ile11、Tyr29、Ile89、Ile103和Phe215共同圍成一個疏水性的區(qū)域，對于維持酶的穩(wěn)定性具有重要作用。對于SB來說，其具體作用尚未被闡明，推測其具有維持酶的剛性結(jié)構(gòu)等作用。

PL18家族的褐藻膠裂解酶相對于PL7家族的褐藻膠裂解酶來說，主要存在兩點差異：一方面，大多數(shù)PL18家族的褐藻膠裂解酶的編碼基因推測的序列中含有N端延伸，起到分子伴侶的作用，從而促進蛋白質(zhì)的正確折疊。這段結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)成熟之后，大多會被切除。另一方面，存在維持酶活的二價金屬離子Ca2+遠離酶的活性中心，不直接參與催化反應，但是對于維持酶活來說至關重要。2種晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析的的PL18家族的酶Aly272、Aly-SJ02均來自Pseudoalteromonas(圖1(b))；成熟的Aly-SJ02酶表現(xiàn)出典型的β果凍卷結(jié)構(gòu)，類似于PL7中內(nèi)切式褐藻膠裂解酶的活性位點結(jié)構(gòu)，Aly-SJ02中含有3條相鄰的β鏈，SA2、SA3、SA4形成兩段敞開的催化溝槽[16]。

PL14家族是所有家族中唯一的一個既包含細菌來源又包含病毒和真菌來源的褐藻膠裂解酶。2種已經(jīng)被表征的14家族褐藻膠裂解酶，是由小球藻病毒產(chǎn)生的vAL-1[17]和Aplysiakurodai產(chǎn)生的AkAly30[18]。vAL-1由N-末端細胞附著結(jié)構(gòu)域和C末端催化結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，目前僅解析了VAL-1的C端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域采取了β果凍卷的結(jié)構(gòu)，對VAL-1進行截短，發(fā)現(xiàn)在pH 7.0的條件下產(chǎn)生二到六糖，在pH 10.0條件下優(yōu)先產(chǎn)生二糖，這表明催化位點表面的電荷改變會影響底物的結(jié)合方式并且調(diào)節(jié)酶的內(nèi)切、外切作用(圖1(c))。

1.2 (α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)(α/α barrel)

(α/α)桶狀結(jié)構(gòu)由3到7個反向平行的α螺旋構(gòu)成，目前有4種采取(α/α)桶狀結(jié)構(gòu)的褐藻膠裂解酶被表征(圖2)，其中有2種來自PL5家族，1種來自PL15家族，1種來自PL17家族(表2)。從結(jié)構(gòu)上來看，PL5家族的褐藻膠裂解酶，是僅含有催化結(jié)構(gòu)域的單結(jié)構(gòu)域蛋白，而PL15、PL17家族的褐藻膠裂解酶，除了催化結(jié)構(gòu)域外還有其他結(jié)構(gòu)域，因此他們屬于多結(jié)構(gòu)域蛋白，采用這種結(jié)構(gòu)酶的催化中心由兩層α螺旋組成，從而形成深隧道狀結(jié)構(gòu)，以容納底物。

表2 具有桶狀結(jié)構(gòu)的褐藻膠裂解酶的特征

2種被表征的PL5家族的褐藻膠裂解酶，Sphingomonassp.產(chǎn)生的A1-III[19]和PseudomonasaeruginosaPAO1產(chǎn)生的PA3547[20]均是內(nèi)切型并且是polyM特異性的褐藻膠裂解酶。A1-III由12個α螺旋構(gòu)成，其中有6個內(nèi)螺旋和5個外螺旋，形成有4個重復發(fā)卡結(jié)構(gòu)的(α6/α5)桶狀結(jié)構(gòu)。褐藻膠進入隧道狀裂縫，被α內(nèi)螺旋所包圍，從而與催化位點的殘基相互作用。PA3547與A1-III相比來看，主要的差異存在于N端和C端結(jié)構(gòu)域(圖2(a))。

Agrobacteriumtumefaciens產(chǎn)生的Atu3025是唯一一個被表征的PL15家族的褐藻膠裂解酶(圖2(b))。它是一種外切型的酶，它由N端小β折疊結(jié)構(gòu)域、(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)域以及C端反相平行β折疊結(jié)構(gòu)域共同組成。其中N端小β折疊結(jié)構(gòu)域的功能尚未被表征，(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)域由15個α螺旋組成，其中有6個內(nèi)螺旋，6個外螺旋組成桶狀催化結(jié)構(gòu)域，C端的β折疊結(jié)構(gòu)域由18條β鏈組成，從而形成三層反向平行的β折疊三明治結(jié)構(gòu)。與PL5家族的褐藻膠裂解酶相比較，Atu3025的活性位點位于(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)域和C端的β折疊結(jié)構(gòu)域，底物跨越兩個結(jié)構(gòu)域與酶的活性位點相互作用[21]。

Saccharophagusdegradans2-40產(chǎn)生的Alg17c是唯一被表征的PL17家族褐藻膠裂解酶，Alg17c是一種外切型的褐藻膠裂解酶(圖2(c))，與PL15家族Atu3025不同的是，Alg17c僅由(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)域和C端反向平行的β折疊結(jié)構(gòu)域組成同源二聚體，但是缺少N端的小β折疊。Alg17c的桶狀區(qū)域由13個螺旋組成，其中12個形成(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)和1個額外的螺旋，額外的螺旋支撐在桶管的側(cè)面，保持其剛性。C端結(jié)構(gòu)域展示出三層反向平行β折疊結(jié)構(gòu)，頂層附近有4個小螺旋，插入2個結(jié)構(gòu)域之間。底物也結(jié)合在(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)域和C端β折疊結(jié)構(gòu)域中[22]。

圖2 具有α螺旋結(jié)構(gòu)的褐藻膠裂解酶的三維結(jié)構(gòu)

1.3 β螺旋結(jié)構(gòu)(β-helix)

PL6家族的AlyGC是唯一的一個采用右手β螺旋的褐藻膠裂解酶(圖3)，它是一種外切性polyG特異性的褐藻膠裂解酶[23]。該酶由N端和C端2個結(jié)構(gòu)域組成，并且這2個結(jié)構(gòu)域都采用β螺旋結(jié)構(gòu)，β螺旋的結(jié)構(gòu)由三段β折疊片組成-PB1、PB2、PB3。2個折疊之間的轉(zhuǎn)角或者環(huán)被稱為T、T1(存在于PB1和PB2之間)、T2(存在于PB2和PB3之間)和T3(存在于PB3和PB1之間)。β螺旋一圈的排列是PB1-T1-PB2-T2-PB3-T3，PB1和PB2幾乎是反平行的，PB3幾乎垂直于PB2。AlyGC的N末端結(jié)構(gòu)域由12個PB1鏈、14個PB2鏈和14個PB3鏈組成。C末端結(jié)構(gòu)域由9個PB1鏈、11個PB2鏈和9個PB3鏈組成。AlyGC的活性位點位于N端結(jié)構(gòu)域，但C端結(jié)構(gòu)域?qū)τ诰S持酶AlyGC的活性來說也是必不可少的。該酶的活性中心是位于N端結(jié)構(gòu)域表面的長裂縫，周圍環(huán)繞著來自N端結(jié)構(gòu)域的β鏈和來自C端結(jié)構(gòu)域的一個環(huán)，該酶活性中心的一端被阻斷，導致酶外切作用模式。

圖3 具有β螺旋結(jié)構(gòu)的褐藻膠裂解酶(PL6家族)的三維結(jié)構(gòu)

2 褐藻膠裂解酶的催化機制

褐藻膠裂解酶通過β消除的方式降解褐藻膠，β消除降解褐藻膠分三步進行：①去除羧基陰離子上的負電荷，然后通過鹽橋(組氨酸或賴氨酸)中和電荷；②需要酶活性中心的一個殘基作為廣義堿，將褐藻膠C5位的質(zhì)子抽走，酶活性中心的另一個殘基作為廣義酸提供質(zhì)子；③來自羧基的電子轉(zhuǎn)移在C4、C5之間形成雙鍵，從而導致含氧糖苷鍵的斷裂[24]。根據(jù)去除C5羧基上負電荷的機制以及廣義酸堿催化時廣義酸和廣義堿的不同，β消除可分為：組氨酸(Tyr)/Tyrβ消除，金屬離子輔助β消除。大部分褐藻膠裂解酶采用His(Tyr)/Tyr 型β消除，采用這種方式進行β消除的酶，大多數(shù)由酶中的Glu、His、Arg或者Asn殘基來消除羧基陰離子上的負電荷。在這種類型的β消除中，Tyr作為廣義酸，提供質(zhì)子。根據(jù)廣義堿的不同，這種類型的β消除又可以進一步進行分類，若廣義堿還為原來的Tyr，則這類消除可定義為Tyr/Tyr型β消除；若廣義堿為His或者另一個Tyr，則可以將這類消除方式定義為 His(Tyr’)/Tyr型β消除。

2.1 Tyr/Tyrβ消除機制

PL5家族中的A1-III采用這種β消除機制(圖4(a))，基于A1-III與三糖降解產(chǎn)物復合結(jié)構(gòu)，預測出Tyr246在酶催化過程中既作為廣義酸又作為廣義堿。在催化過程中C5端羧基的負電荷首先被Arg239和Asn191所中和，因此C5中的質(zhì)子相對容易被移除，形成一個羧酸鹽二價陰離子中間體，緊接著Tyr246作為廣義堿從甘露糖醛酸C5中提取質(zhì)子，然后Tyr246又作為廣義酸向糖苷鍵提供質(zhì)子，從而在C4和C5之間形成雙鍵，進而導致糖苷鍵的斷裂[19]。PL18家族的 aly-SJ02也采用這種催化機制，在 aly-SJ02中，Tyr353殘基在催化過程中既作為廣義酸又作為廣義堿，aly-SJ02活性中心的保守殘基包括Arg219、Lys223、Gln257、His259、Tyr347以及 Lys349，這些保守位點的殘基起到識別并且結(jié)合褐藻膠羧基的作用[16]。

2.2 His(Tyr’)/Tyrβ消除機制

His(Tyr’)/Tyr 型β消除機制既適用于順式消除又適用于反式消除，順式消除和反式消除的選取取決于酶+1位點結(jié)合的底物殘基，因此對于雙功能的酶來說，它既可以采取順式消除又可以采取反式消除。對于特異性降解G片段的酶來說，它們只能采取反式消除，而特異性降解M的酶只能采取順式消除。在這種消除機制中，Glx(Glu和Gln)和Asx(Asp和Asn)殘基通常作為中和劑，來中和+1位點處結(jié)合糖醛酸羧基端的負電，一些帶正電荷的氨基酸殘基如His和Arg通過與底物形成氫鍵來輔助中和負電。在這一類消除機制中，Tyr殘基通常作為廣義酸提供質(zhì)子。對于采取順式消除的酶來說，通常采用相同的Tyr作為廣義堿來接受質(zhì)子；而對于采取反式消除的酶來說，通常采用His殘基來接受質(zhì)子。

A1-II’是PL7家族中首先被闡述催化機制的一種酶，通過對該酶與褐藻酸鹽四糖(GGMG)復合物的分析，在催化過程中A1-II’中的Gln189充當中和劑，用來去除C5端羧基的負電荷，His191在催化過程中充當廣義堿，Tyr284在催化過程中充當廣義酸[25]。PL15家族催化機制唯一被表征的酶是Atu3025，這是一種內(nèi)切型以及雙功能的酶，通過分析該酶的突變體和褐藻酸三糖(ΔGGG)的復合物可以得出：Atu3025中帶正電荷的氨基酸殘基 Arg199、Arg314和His531在催化過程中起到穩(wěn)定以及中和C5羧基負電荷的作用，該酶的His311殘基在催化過程中充當廣義堿，接受質(zhì)子，而Tyr365殘基在催化過程中充當廣義酸，提供質(zhì)子[21]。

PL17家族的Alg17c采用Tyr’/Tyr 型β消除(圖4(b))，這種消除機制與His/Tyr型β消除有細微的差別，通過分析突變菌株與ΔMMG復合物的結(jié)構(gòu)，可以得出該酶的Tyr450殘基作為廣義堿從C5中抽取一個質(zhì)子，Tyr258殘基作為廣義酸在催化過程中起到提供質(zhì)子的作用。該酶中的Asn201和His202 兩個殘基在催化過程中起到穩(wěn)定以及中和羧基端負電荷的作用[22]。

關于PL14家族褐藻膠裂解酶催化機制報道較少。小球藻病毒產(chǎn)的酶vAL-1的催化過程對pH值有較大的依賴性，通過對結(jié)構(gòu)和突變分析，Lys197殘基對酶在pH7.0條件下維持活性起到重要的作用，Ser219殘基在pH10.0條件下對維持該酶活性至關重要[17]。對于polyM特異性真核酶AkAly30，其與底物結(jié)合模型顯示Lys99殘基在+1位點處與polyM殘基形成離子鍵，Tyr140和Tyr142殘基偶聯(lián)在一起并與糖苷鍵形成氫鍵網(wǎng)絡。由此可以看出這2種PL14家族酶的催化機制有著很大的不同[18]。

2.3 金屬離子輔助型β消除機制

PL6家族所有已經(jīng)表征了的酶均采用Ca2+輔助β消除的機制來降解褐藻膠(圖4(c))，通過對酶AlyGC的結(jié)構(gòu)進行分析，可發(fā)現(xiàn)Ca2+與Asn181、Glu213、Glu215和Glu184殘基共同位于酶的活性中心，在催化過程中的作用類似于His(Tyr’)/Tyr型β消除中Glx和Asx的作用，中和+1位點處所結(jié)合糖醛酸羧基的負電。在這種類型的β消除中，Lys220充當廣義堿，Arg241充當廣義酸[23]。

圖4 不同類型的褐藻膠裂解酶的反應機制

3 結(jié)論

褐藻膠裂解酶是多糖裂解酶家族中的一種酶，按照褐藻膠裂解酶的序列來看，目前已經(jīng)表征的褐藻膠裂解酶可分屬到7個多糖裂解酶家族。本文中，筆者介紹了目前已經(jīng)表征的酶的結(jié)構(gòu)，褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)大致可以分為三類：β果凍卷、(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)以及β螺旋結(jié)構(gòu)。采用β果凍卷結(jié)構(gòu)的酶主要是由2個β折疊片和少量的α螺旋組成的球狀結(jié)構(gòu)，PL7、PL14、PL18家族的褐藻膠裂解酶多采取這類的結(jié)構(gòu)。(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)通常由3到7個α螺旋組成，PL5、PL15、PL17家族的褐藻膠裂解酶大多采取這種結(jié)構(gòu)。β螺旋結(jié)構(gòu)由三段β折疊片以及轉(zhuǎn)角和環(huán)組成，PL6家族的褐藻膠裂解酶多采取這種結(jié)構(gòu)。

褐藻膠裂解酶通過β消除來降解褐藻膠，根據(jù)催化過程中有無金屬離子輔助，β消除可進一步分為His(Tyr)/Tyrβ消除和金屬離子輔助型β消除，在His(Tyr’)/Tyrβ消除中，根據(jù)+1位點處結(jié)合底物殘基的不同，β消除又可分為順式消除和反式消除。盡管對部分褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)和催化機制有了很深入的研究，仍然有大部分的酶尚未表征，需要進一步去研究。