萬屹東，高有軍，馬江鋒

(1.常茂生物化學(xué)工程股份有限公司，江蘇 常州 213034；2.江蘇省生化手性工程技術(shù)研究中心，江蘇 常州 213034；3.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

丁二酸作為重要的C4平臺化合物擁有巨大的市場需求，可作為鮮味劑、食品鐵質(zhì)強化劑、分析試劑、配制電鍍藥水、清洗添加劑等應(yīng)用于食品工業(yè)與化學(xué)工業(yè)，同時可作為聚合單體合成生物可降解材料聚丁二酸丁二醇酯(PBS)和耐高溫特殊尼龍(PA-X4)[1]。此外，基于丁二酸線性的分子結(jié)構(gòu)和二元羧酸特性，可作為前體進一步合成多個大宗化學(xué)品，如1,4-丁二醇(聚酯纖維和氨綸的單體)、γ-丁內(nèi)酯(農(nóng)藥、除草劑和部分藥物的前體)、四氫呋喃(聚四亞甲基醚二醇合成的前體和助劑)、己二酸(尼龍PA-X6的單體)和N-甲基吡咯烷酮(化工和鋰電池工業(yè)中的重要溶劑)，預(yù)計至2020年市場需求將達到70萬t[2]。

目前丁二酸的生產(chǎn)主要以丁烷為原料，通過催化加氫等步驟進行化學(xué)合成，其生產(chǎn)工藝成熟，較生物基丁二酸的制備具有顯著成本優(yōu)勢，但其依賴原油，因此成本受原油價格波動影響較大、原料不可再生且生產(chǎn)過程污染嚴重[3]。在石油危機及環(huán)境污染的雙重壓力下，微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸因具有利用可再生資源、固定溫室氣體CO2等優(yōu)點，近年來成為國內(nèi)外研究的熱點而受到廣泛關(guān)注。

美國能源部在20世紀90年代初提出了替代性原料計劃,并聯(lián)合了Argonne National Laboratory、OakRidge National Laboratory、Pacific Northwest National Laboratory和National Renewable Energy Laboratory(NREL)這4個國家級實驗室聯(lián)合進行丁二酸生物轉(zhuǎn)化和提取技術(shù)的攻關(guān)。如今，已經(jīng)有多家企業(yè)建立了商業(yè)化的生物基丁二酸生產(chǎn)線，并開始對外提供生物基丁二酸樣品供下游產(chǎn)品的開發(fā)以滿足丁二酸的市場需求。荷蘭DSM和法國Roquette兩家公司聯(lián)合成立的Reverdia公司于2014年對外聲明在意大利建立了采用酵母菌低pH發(fā)酵的10 000噸/年生產(chǎn)能力的商業(yè)化生物基丁二酸裝置(http://www.reverdia.com/news-events/news/)。美國BioAmber公司于2015年聲明其合資公司 Sarnia和日本三井公司合作，建成了基于低pH發(fā)酵工藝設(shè)計和建設(shè)的30 000噸/年生物基丁二酸生產(chǎn)裝置(https://www.bio-amber.com/bioamber/en/company)。除此之外，美國Myriant也建立了采用銨鹽法中性發(fā)酵工藝的14 000噸/年的生物基丁二酸裝置(http://www.myriant.com/)。荷蘭CorbionPurac和德國BASF聯(lián)合成立的Succinity公司在西班牙建立了采用中性發(fā)酵工藝的14 000噸/年的生物基丁二酸裝置(http://www.succinity.com/about-us)。國內(nèi)中國石化揚子石油化工股份有限公司與南京工業(yè)大學(xué)合作，設(shè)計和建造了采用鈉鹽法中性發(fā)酵的1 000噸/年生物基丁二酸中試生產(chǎn)裝置。

生物基丁二酸已經(jīng)初步實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，但與生物基富馬酸、蘋果酸等生物煉制有機酸產(chǎn)品一樣，其主要問題是比化學(xué)合成的制造成本要高。檸檬酸的生物制造是目前有機酸生物煉制中最成功的案例之一。20世紀末我國天津工業(yè)微生物所、上海工業(yè)微生物所以及企業(yè)家的聯(lián)合攻關(guān)，在菌株、發(fā)酵過程及放大過程三方面取得了重大成果，目前檸檬酸發(fā)酵技術(shù)(檸檬酸的平均生產(chǎn)質(zhì)量濃度、生產(chǎn)速率和總收率分別約為150 g/L、3 g/(L·h)和90%，車間成本在4 000元/噸左右)處于世界領(lǐng)先水平[4]。中國有檸檬酸生產(chǎn)廠近百家，總年產(chǎn)能力約100萬t，是全球最大的檸檬酸生產(chǎn)國和出口國，如安徽豐原生化公司的檸檬酸生產(chǎn)能力達18萬t，占世界檸檬酸生產(chǎn)額的17%，居世界第一位[4-5]。因此，利用先進的合成生物學(xué)、代謝工程等技術(shù)，結(jié)合分離工藝模擬、設(shè)計及優(yōu)化，提高丁二酸的生產(chǎn)效率，將有助于實現(xiàn)生物基丁二酸的低成本制造，具備與石油基丁二酸相競爭的成本優(yōu)勢[6]。

本文中，筆者針對國內(nèi)外生物基丁二酸生產(chǎn)成本偏高以及產(chǎn)品原料依賴糧食資源等問題，從生產(chǎn)菌株、非糧碳源、發(fā)酵工藝和分離工藝四方面進行綜述，并預(yù)測未來具有經(jīng)濟性的工藝路線，為生物基丁二酸的綠色、高效和低成本制造提供借鑒。

1 丁二酸生產(chǎn)菌株

1.1 野生菌株

產(chǎn)丁二酸野生菌株主要包括產(chǎn)琥珀酸放線桿菌[7]、曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌[8]、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌[9]和鈍齒棒桿菌[10]等(表1)。丁二酸是三羧酸途徑(TCA)的終端產(chǎn)物之一，其合成途徑如圖1所示，因此在厭氧條件下諸多野生型菌株也能積累丁二酸。

1—Embden-Meyerhof途徑；2—丙酮酸激酶；3—磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；4—丙酮酸羧化酶；5—丙酮酸脫氫酶；6—檸檬樹合成酶；7—蘋果酸脫氫酶；8—富馬酸酶；9—富馬酸還原酶；10—順烏頭酸酶；11—異檸檬酸裂解酶；12—異檸檬樹裂解酶；13—蘋果酸合酶；14—乳酸脫氫酶；15—丙酮酸裂解酶；16—磷酸轉(zhuǎn)乙?；负鸵宜峒っ?；17—乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶

表1 產(chǎn)丁二酸野生菌株

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌最先是從牛瘤胃內(nèi)容物中分離得到的一種兼性厭氧、不運動的革蘭氏陰性桿菌，該菌在厭氧環(huán)境中可以利用廣泛的碳源，如葡萄糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖和其他還原性糖[18]。研究人員考察了該菌對一些廢棄生物質(zhì)的利用情況，如乳清[12]、甘蔗糖蜜[14]、稻草[15]、玉米芯[11,16]、秸稈[13]、麩皮[19]和浮萍[20]等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌具有利用多種生物質(zhì)的天然特性，在低劣生物質(zhì)綜合利用方面具有顯著優(yōu)勢，能夠通過菌株原料預(yù)處理、發(fā)酵過程控制等策略實現(xiàn)全糖利用。

曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌是從牛的瘤胃中分離篩選得到的另一株兼性厭氧嗜CO2革蘭氏陰性菌。以葡萄糖為碳源，厭氧發(fā)酵時丁二酸是主要產(chǎn)物，乙酸和甲酸為主要副產(chǎn)物，比例為2∶ 1∶ 1。此外，利用乳清為底物，以玉米浸出物代替酵母提取物發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，收率71%，生產(chǎn)速率達到1.18 g/(L·h)[8]。

產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌是從小獵犬的口腔中分離得到的一株革蘭氏陰性、嚴格厭氧菌，以葡萄糖為碳源厭氧發(fā)酵時，主產(chǎn)物為丁二酸和乙酸，同時生成少量的甲酸、乙醇和乳酸[21]。但產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌不能耐受高滲透壓，最優(yōu)底物葡萄糖為20～80 g/L，而且不能耐受高濃度的丁二酸鹽。因此，Meynial-Salles等[9]通過耦合電滲析過程并結(jié)合膜生物反應(yīng)器，產(chǎn)物丁二酸產(chǎn)量提高至83 g/L，且收率和生產(chǎn)速率分別達到1.35 mol/mol和10.4 g/(L·h)，具有一定的應(yīng)用前景。

鈍齒棒桿菌是一株產(chǎn)谷氨酸菌，Chen等[10]篩選得到一株鈍齒棒桿菌，該菌有氧發(fā)酵時能生產(chǎn)谷氨酸，回收細胞轉(zhuǎn)厭氧發(fā)酵能夠利用合成培養(yǎng)基發(fā)酵制備丁二酸，且細胞能夠重復(fù)回收利用多次。當以麥麩水解液為碳源發(fā)酵時，丁二酸產(chǎn)量和生產(chǎn)速率分別達到43.6 g/L和4.36 g/(L·h)。

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌和曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌等野生菌株能夠高收率、高濃度制備丁二酸，但這類菌多為營養(yǎng)缺陷型，往往依賴營養(yǎng)豐富的復(fù)合培養(yǎng)基，而高昂的培養(yǎng)基成本使得這類菌株的經(jīng)濟性大大降低。

1.2 基因工程菌株

隨著基因測序、基因編輯技術(shù)及基因精細調(diào)控表達等技術(shù)的進步，從分子層面改造微生物代謝網(wǎng)絡(luò)提高丁二酸生產(chǎn)效率的研究已經(jīng)取得了一定的成果(表2)。綜合各種代謝工程改造策略，丁二酸基因工程菌的構(gòu)建主要包括：敲除或突變副產(chǎn)物合成途徑相關(guān)基因、外源引入或超量表達丁二酸合成途徑相關(guān)酶、提高底物利用效率及優(yōu)化輔因子代謝。

表2 產(chǎn)丁二酸代謝工程菌株

1.2.1 敲除或突變副產(chǎn)物合成途徑相關(guān)基因

為超量積累目標產(chǎn)物，首先需要解決副產(chǎn)物積累的問題，可以通過敲除或突變副產(chǎn)物合成途徑中關(guān)鍵酶基因來減少副產(chǎn)物的合成。在丁二酸基因工程菌株中，主要包括有氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵兩類生產(chǎn)菌。針對有氧丁二酸生產(chǎn)菌株，Lin等[28-29]通過失活大腸桿菌的sdhAB、poxB、ackA-pta、iclR和ptsG基因構(gòu)建獲得了重組菌E.coliHL27659k，該菌株發(fā)酵59 h積累58.3 g/L丁二酸，收率為0.56 g/g。Otero等[36]結(jié)合進化代謝選育并敲除釀酒酵母SDH3P和Ser3p/Ser33p基因，維持細胞生長與代謝合成丁二酸的過程，最終產(chǎn)物濃度比出發(fā)菌株提高了43倍。Yuzbashev等[33]敲除解脂耶氏酵母SUC2和SDH2基因并突變了SDH1基因，獲得的重組菌在低pH下以甘油為碳源發(fā)酵制備丁二酸，產(chǎn)量達到45 g/L，該技術(shù)具有顯著減少下游分離步驟的作用。針對厭氧丁二酸生產(chǎn)菌株，敲除ldhA、pflB、adh以及pta、ackA、poxB基因可以減少乳酸、甲酸、乙醇和乙酸的積累，而失活磷酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(PTS)中的葡萄糖專性轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因ptsG可以減少丙酮酸的生成，促使更多的碳代謝流流向還原三羧酸途徑。其中，重組大腸桿菌KJ073(ldhA、adhE、ackA、focA-pB、mgsA、poxB)利用合成培養(yǎng)基，以葡萄糖為碳源厭氧發(fā)酵，丁二酸的收率達到1.2 mol/mol[37]。Lee等[35]敲除曼海姆產(chǎn)琥珀酸菌中的ldhA、pflB、pta和ackA基因構(gòu)建獲得了重組菌M.succiniciproducensLPK7，該菌株在分批發(fā)酵過程中積累52.4 g/L丁二酸，收率為1.16 mol/mol，生產(chǎn)速率達到1.8 g/(L·h)。

1.2.2 外源引入或超量表達丁二酸合成途徑相關(guān)酶

在敲除或突變與副產(chǎn)物合成相關(guān)基因的基礎(chǔ)上，進一步強化丁二酸合成途徑相關(guān)基因的表達是提高丁二酸合成效率的另一種策略。Wang等[38]通過敲除大腸桿菌中l(wèi)dhA、pflB和ptsG基因并過量表達來源于藍細菌的ppc基因獲得重組菌株SD121，該菌株利用秸稈水解液厭氧發(fā)酵，丁二酸達到36.5 g/L，收率為0.83 g/g。另一方面，若在ppc基因缺失的菌株中超量表達pck基因，使得催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)至草酰乙酸的反應(yīng)能額外產(chǎn)生一分子ATP，可促進菌株在厭氧條件下的生長性能，進而提高丁二酸的生產(chǎn)效率[37]。Yang等[39]基于提高菌株產(chǎn)物合成速率的計算機模擬方法，在有氧丁二酸生產(chǎn)菌E.coliZJG13中超量表達pyc基因，結(jié)果表明重組菌E.coliZJG13/pT184pyc的平均生產(chǎn)速率比丁二酸的明顯提高。Okino等[30]敲除了谷氨酸棒桿菌的ldhA基因并表達pyc基因，重組菌所產(chǎn)的丁二酸達到146 g/L，厭氧階段收率0.92 g/g。在嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)中采用相同的策略也實現(xiàn)丁二酸的超量積累，丁二酸超過100 g/L，收率為1.34 mol/mol[31]。Yan等[32]在缺失pdc、fum1基因的釀酒酵母中過量表達pyc2和mdh3r基因并引入來源于大腸桿菌的fumC、frds1基因，構(gòu)建獲得的重組釀酒酵母在pH3.8的酸性環(huán)境下發(fā)酵也能積累12.9 g/L丁二酸。

1.2.3 提高底物利用效率

在野生型大腸桿菌中，葡萄糖的轉(zhuǎn)運和磷酸化主要采用PTS系統(tǒng)完成，該轉(zhuǎn)運系統(tǒng)每轉(zhuǎn)運1分子葡萄糖需要消耗1分子磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)[40]。PEP是厭氧丁二酸合成過程中重要的前體物質(zhì)，為了提高還原三羧酸途徑中PEP的供給，Lu等[41]失活了PTS系統(tǒng)使得葡萄糖的轉(zhuǎn)運采用激酶途徑，結(jié)果導(dǎo)致葡萄糖代謝速率顯著下降，進一步構(gòu)建啟動子和mRNA穩(wěn)定區(qū)文庫精細調(diào)控半乳糖透性酶和葡萄糖激酶基因的表達，使得葡萄糖消耗速率達到1.64 g/(L·h)，代謝速率提高了10倍。

木糖是纖維素水解液的主要成分之一，來源廣泛，可作為微生物發(fā)酵的重要碳源。Liu等[42]研究發(fā)現(xiàn)，野生型大腸桿菌可以利用木糖進行厭氧有機酸發(fā)酵，但當敲除乳酸和甲酸、乙酸生成相關(guān)的編碼基因pflB和ldhA后，菌株在厭氧條件下不能利用木糖生長和代謝。進一步通過敲除自身ppc基因并引入來源于枯草芽孢桿菌的pck基因，提高了胞內(nèi)ATP的供給，從而恢復(fù)了菌株的木糖利用能力。在以秸稈水解液為碳源的發(fā)酵過程中，丁二酸的收率達到1.02 g/g，該研究證實了木糖代謝較葡萄糖代謝需要更多的ATP供給，供給不足將導(dǎo)致菌株生長及代謝受到抑制。

除單糖外，二糖、多糖等也可作為丁二酸發(fā)酵的碳源。Inokuma等[43]和Park等[44]研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建細胞表面展示系統(tǒng)將相關(guān)的水解酶固定在細胞表面，促使二糖、多糖在胞外水解并獲得單糖，進而可作為細胞生長及代謝所需的碳源。Ma等[45]利用細胞表面展示技術(shù)以產(chǎn)丁二酸重組大腸桿菌AFP111為出發(fā)菌株，以O(shè)mpC為錨定蛋白將蔗糖水解蛋白錨定在細胞表面，最終菌株能夠利用蔗糖發(fā)酵制備丁二酸。當以蔗糖和糖蜜為碳源時，發(fā)酵34 h時丁二酸的質(zhì)量濃度分別達到41和36.3 g/L。

1.2.4 優(yōu)化輔因子代謝

微生物胞內(nèi)存在氧化還原平衡，其分子基礎(chǔ)是NAD(P)+和NAD(P)H等輔因子對的比例。當對微生物胞內(nèi)代謝途徑進行重構(gòu)后，往往會引起輔因子比例的變化，影響菌株生長及代謝。Vemuri等[46]敲除了大腸桿菌ldhA和pflB基因獲得E.coliNZN111，該菌株由于降低了NAD+的再生效率，導(dǎo)致胞內(nèi)輔因子失衡，因此在厭氧條件下不能以葡萄糖為碳源生長。針對NZN111生長抑制的問題，Liang等[47-49]先后采用兩種策略恢復(fù)了其生長及代謝能力，一是通過mdh基因的超量表達強化NADH的消耗速率，二是從NAD+原始生物合成途徑出發(fā)提高NAD+的總量使之不容易失衡。Zhou等[50]在枯草芽孢桿菌中引入來源于大腸桿菌的pntAB基因，其表達的酶能夠催化NAD(H)和NADP(H)相互轉(zhuǎn)化，以維持胞內(nèi)輔因子的平衡，最終該重組枯草芽孢桿菌丁二酸收率和質(zhì)量濃度分別提高了16%和57%。

2 底物碳源

2.1 主要非糧生物質(zhì)碳源

淀粉質(zhì)碳源是目前生物基丁二酸發(fā)酵的主要碳源，但在“不與民爭糧，不與民爭地”的方針原則下，開發(fā)其他低成本碳源迫在眉睫。根據(jù)揚子石油化工股份有限公司“1 000噸/年丁二酸中試生產(chǎn)裝置”連續(xù)3批發(fā)酵數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)未公布)結(jié)果分析，碳源約占丁二酸生產(chǎn)成本的45%～50%。因此，如何降低碳源成本是建立經(jīng)濟性的丁二酸生產(chǎn)工藝需要重點考慮的問題之一?；诖?，眾多研究者考察了諸如纖維素水解液等低品位碳源在丁二酸發(fā)酵體系中的利用情況。

Chen等[51]通過營養(yǎng)定向補給策略，采用廢酵母細胞水解液和玉米秸稈水解液復(fù)配的方法，A.succinogenesNJ113能積累70.3 g/L丁二酸，收率和生產(chǎn)速率達到67.7%和0.63 g/(L·h)。Liu等[42]以蔗渣水解液為原料，利用重組大腸桿菌BA204兩階段發(fā)酵，厭氧階段丁二酸收率達到0.96 g/g。連續(xù)糖化發(fā)酵可減少預(yù)處理步驟，Zheng等[52]和Chen等[53]分別考察了A.succinogenes和E.coli連續(xù)糖化發(fā)酵制備丁二酸的可能性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過在發(fā)酵介質(zhì)中添加纖維素酶和纖維二糖酶可以利用經(jīng)過簡單稀酸處理的纖維素物質(zhì)，最高的丁二酸質(zhì)量濃度達到47.7 g/L。

盡管水解秸稈等木質(zhì)纖維素原料用于發(fā)酵制備丁二酸具有環(huán)境友好、來源廣泛以及成本低廉等優(yōu)點，但現(xiàn)有的半纖維素水解技術(shù)往往導(dǎo)致水解液中含有糠醛、羥甲基糠醛和甲酸等抑制物，若不經(jīng)過脫毒處理，這類物質(zhì)將在發(fā)酵過程中影響微生物的生長及代謝，并影響最終丁二酸產(chǎn)品品質(zhì)[54-55]。為了提高菌株的發(fā)酵效率，Wang等[56]在大腸桿菌中過量表達糠醛降解基因獲得重組菌E.coliXW36，該菌株能利用未脫毒半纖維素水解液發(fā)酵制備丁二酸，產(chǎn)物質(zhì)量濃度和收率達到32 g/L和0.9 g/g。

2.2 氣態(tài)碳源——CO2氣體

除了過程中采用碳酸鹽外，在發(fā)酵初始需要大量的CO2氣體以使得發(fā)酵環(huán)境成為厭氧環(huán)境，因此厭氧發(fā)酵丁二酸工業(yè)生產(chǎn)必須具備直接的CO2氣體供應(yīng)能力。而采用純CO2壓縮氣體成本較高，如果能與企業(yè)現(xiàn)有的排放CO2氣體的生產(chǎn)裝置(如環(huán)氧乙烷裝置、生物乙醇裝置、甲烷裝置等)耦合或是進行過境處理，不僅能降低溫室氣體的排放，也能解決厭氧丁二酸發(fā)酵氣態(tài)碳源的問題。Wu等[58]考察了環(huán)氧乙烷尾氣(環(huán)氧乙烷裝置實際的尾氣中含氧量在1.2%以內(nèi))為CO2氣態(tài)碳源厭氧發(fā)酵制備丁二酸的可行性，結(jié)果丁二酸終質(zhì)量濃度為68.1 g/L，CO2氣體固定速率達到4.7 mmol/(L·h)，基本與純CO2氣體發(fā)酵性能基本一致，且環(huán)氧乙烷尾氣含氧量在2%范圍以內(nèi)波動對發(fā)酵無影響。

3 丁二酸生產(chǎn)工藝

3.1 發(fā)酵工藝

針對生物基丁二酸的發(fā)酵工藝已經(jīng)有大量的研究成果，除了常見的分批發(fā)酵和補料發(fā)酵[59]策略外，研究者還設(shè)計并形成了細胞循環(huán)利用技術(shù)、分階段連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)以及基于膜技術(shù)的發(fā)酵分離耦合工藝等[60-62]。Beauprez等[63]總結(jié)了現(xiàn)有的眾多的發(fā)酵策略，在肯定了這些策略的優(yōu)點之余，也提出了存在的問題。眾所周知，丁二酸是大宗化學(xué)品，價格偏低，對生產(chǎn)成本控制要求高，因此需要進行大規(guī)模的生產(chǎn)，比較合理的發(fā)酵體積在100 m3左右。基于此，很多復(fù)雜的發(fā)酵策略因其投資和操作成本高、維護困難以及運轉(zhuǎn)穩(wěn)定性偏差等問題很難實施。比如，利用超濾膜進行細胞循環(huán)利用在大規(guī)模發(fā)酵過程中就存在易導(dǎo)致染菌、膜易被堵塞等問題[64]。因此，在諸如丁二酸這類大宗化學(xué)品的發(fā)酵策略的選擇上必須考慮其對生產(chǎn)成本的影響以及在實際生產(chǎn)中的操作難度。

3.2 產(chǎn)品分離工藝

3.2.1 傳統(tǒng)有機酸分離工藝-鈣鹽法

傳統(tǒng)的有機酸工業(yè)化生產(chǎn)，如檸檬酸、乳酸、衣康酸均采用鈣鹽法[5,65-66]。該技術(shù)成熟，且生產(chǎn)成本低，但會產(chǎn)生大量的硫酸鈣沉淀(即石膏)，大量固廢的產(chǎn)生對環(huán)境影響較大。同時，該技術(shù)只適合低pH(pH<5)發(fā)酵，對于中性發(fā)酵工藝，鈣鹽法缺點很多，如必須額外添加酸中和劑。

3.2.2 銨鹽法

銨鹽法是指在發(fā)酵過程中采用氨水調(diào)節(jié)pH并形成丁二酸二銨，在分離階段經(jīng)固液分離后采用硫酸或硫酸氫銨酸化生成丁二酸和硫酸銨并進化后續(xù)的純化步驟。其中丁二酸可通過濃縮、結(jié)晶沉淀進行純化，剩余的母液主要含有硫酸銨和約7%的丁二酸，該母液可直接作為化肥銷售，也可采用熱裂解的方法重新生成氨氣和硫酸氫銨[67-68]。

該技術(shù)較鈣鹽法的優(yōu)勢是采用廉價的氨水為原料，且可利用循環(huán)閉合工藝回收氨氣，同時產(chǎn)生的母液是含部分丁二酸的硫酸銨溶液，可直接作為化肥銷售。其缺點是采用氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵過程pH值，對微生物的發(fā)酵產(chǎn)生了一定的抑制作用[69]，未來需要在菌株構(gòu)建和馴化過程中提高其對銨鹽的耐受性能和利用能力。同時，母液中損失的丁二酸降低了整個產(chǎn)品的分離收率。

3.2.3 電滲析法

電滲析法是指在發(fā)酵過程中采用NaOH作為酸中和劑形成丁二酸二鈉，進而采用電滲析膜一步實現(xiàn)固液分離和濃縮丁二酸二鈉[70]。Dunuwilla等[71]在丁二酸體系中采用雙極膜電滲析，借助電勢的作用分離獲得丁二酸和NaOH。

該技術(shù)的優(yōu)勢是發(fā)酵過程采用了廉價的NaOH作為酸中和劑，且該物質(zhì)能在下游分離過程中回收獲得，且整個過程不會產(chǎn)生大量的鹽。其缺點是鈉鹽對發(fā)酵過程同樣存在抑制，尤其是采用NaOH時。同時雙極膜電滲析的使用需要高昂的設(shè)備投資及相應(yīng)的自動化裝備投入，雙極膜的壽命也是制約其普及的另一因素。

3.2.4 直接結(jié)晶工藝

與上述3種工藝不同，直接結(jié)晶工藝依賴低pH發(fā)酵過程，即在丁二酸整個發(fā)酵過程中不調(diào)節(jié)pH，因此發(fā)酵液中存在大量游離的丁二酸。該方法的優(yōu)勢顯而易見，即簡化了分離步驟，降低了下游設(shè)備投資，提高了分離收率。但該方法要求微生物具有較強的耐低pH性能，而提高細胞的耐受性能會消耗額外的能量[72]，因而導(dǎo)致產(chǎn)物收率的下降。因此，需要對丁二酸生產(chǎn)菌株進行必要的基因工程改造并結(jié)合合適的胞外控制策略提高丁二酸的生產(chǎn)效率。

4 結(jié)論與展望

通過對現(xiàn)有丁二酸生產(chǎn)工藝與乳酸、酒精發(fā)酵工藝的比較，筆者認為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸的主要技術(shù)屏障包括：①現(xiàn)有丁二酸生產(chǎn)菌株未具備較高的魯棒性，在厭氧條件下尤其是采用低品位生物質(zhì)時，其生長及代謝性狀較差。②下游過程分離步驟較多及三廢排放偏高。③未考慮綜合性工藝系統(tǒng)和工業(yè)化裝備等問題。

因此，建立經(jīng)濟性的丁二酸發(fā)酵工藝需要具備的要素包括：①提高生產(chǎn)速率?？梢詼p少發(fā)酵設(shè)備投資和發(fā)酵的運行成本。如果要在經(jīng)濟性上有競爭力，最小的生產(chǎn)速率應(yīng)達到2.5 g/(L·h)。②減少營養(yǎng)需求。產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程要求在保證菌株生長及代謝性能的基礎(chǔ)上，使用最少的營養(yǎng)。像酵母膏、生物素這樣價格高的營養(yǎng)成分應(yīng)當除去。營養(yǎng)需求應(yīng)限制像玉米浸膏或價格相當?shù)某煞帧＂厶岣咦罱K的產(chǎn)物濃度。產(chǎn)品最終的發(fā)酵濃度是影響整個工藝生產(chǎn)成本的重要因素，尤其是下游分離過程的能耗，因此較高的最終產(chǎn)物濃度將減少分離和濃縮的成本。④提高菌株對低pH的耐受性。理想的情況是發(fā)酵在低pH下運行，不需要任何的堿中和，否則發(fā)酵階段的中和過程及下游分離階段鹽轉(zhuǎn)換為游離酸的過程會大大增加生產(chǎn)成本。

預(yù)測兩條經(jīng)濟性較高的丁二酸合成路線：①極低pH發(fā)酵(pH<3)，發(fā)酵過程不中和，下游采用結(jié)晶工藝，該路線要求菌株具有較高的耐酸性能和在低pH環(huán)境下的代謝性能，同時生產(chǎn)設(shè)備也需要采用相應(yīng)耐腐蝕性能的材質(zhì)。②中性pH發(fā)酵(pH 6.5～7.5)，發(fā)酵過程氨水中和，下游采用銨鹽閉合循環(huán)工藝，該路線要求菌株具有耐高濃度銨根離子的性能。