張飛龍，楊衛(wèi)華，陳明亮，嚴(yán)燕兵，唐云平，肖延銘

(1.長興制藥股份有限公司 工業(yè)生物催化與轉(zhuǎn)化浙江省工程研究中心，浙江 長興 313100；2.浙江海洋大學(xué) 食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022)

度魯特韋是人類免疫缺陷病毒類型I(HIV-1)整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制藥，其化學(xué)合成所需原料較多，(R)-3-氨基丁醇是其重要原料之一，(R)-3-氨基丁酸(R-3-ABA)主要作為醫(yī)藥中間體(R)-3-氨基丁醇的前體物[1-2]。目前，國內(nèi)對于(R)-3-氨基丁醇的制備主要還是傳統(tǒng)的化學(xué)方法，包括：化學(xué)拆分法、化學(xué)誘導(dǎo)法、手性原料合成法和制備色譜法等。但采用以上方法制備(R)-3-氨基丁醇易對環(huán)境造成較大的污染且收率不高，不利于節(jié)能減排[3-4]。開發(fā)具有高效、低成本的路線合成高純度的(R)-3-氨基丁酸是降低度魯特韋原料藥成本、推廣其應(yīng)用范圍的關(guān)鍵步驟。相對于化學(xué)法，利用生物酶法催化技術(shù)建立一個(gè)低成本、高效、環(huán)保，且制備工藝簡單，有利于工業(yè)化生產(chǎn)的工藝將具有更加廣泛的應(yīng)用前景。

天冬氨酸酶，也稱天冬氨酸裂氨酶(EC 4.3.1.1，Asp)，是特異于天冬氨酸或其衍生物為底物的3種類型的氨裂解酶之一，在氮代謝中起著重要的作用，通過催化L-天冬氨酸可逆地消除氨并產(chǎn)生富馬酸鹽[5-6]。目前研究的幾種相關(guān)的天冬氨酸酶包括大腸桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌和芽孢桿菌YM55-1。其中研究最多的是大腸桿菌天冬氨酸酶(AspA)和芽孢桿菌YM55-1天冬氨酸酶(AspB)[7-10]。AspA是已知最具特異性的酶之一，但AspA對其天然底物的高選擇性限制了該酶的實(shí)際應(yīng)用。與AspA相比，AspB具有較高的活性和對映體選擇性、廣泛的親核試劑特異性、相對熱穩(wěn)定性以及缺乏底物或金屬離子的變構(gòu)調(diào)節(jié)，從而在有機(jī)合成領(lǐng)域引起了研究者極大的興趣[11]。

已有研究報(bào)道天冬氨酸酶基因T187、K324和N326為底物C1羧基的結(jié)合殘基，本研究通過克隆構(gòu)建、定點(diǎn)突變獲得了重組天冬氨酸酶(AspBm)[12]，利用酶催化將底物巴豆酸轉(zhuǎn)化為(R)-3-氨基丁酸(圖1)。與傳統(tǒng)化學(xué)方法合成相比，酶法制備更加安全、環(huán)保，制成固定化細(xì)胞用于工業(yè)化生產(chǎn)使得生產(chǎn)成本大大降低[13]。

圖1 天冬氨酸酶催化合成(R)-3-氨基丁酸

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)菌基因組DNA制備試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA清潔試劑盒，Axygen公司；限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、DpnⅠ，TaKaRa公司；引物合成和基因測序，杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司。胰蛋白胨、酵母提取物，Oxoid公司，硅藻土、戊二醛、聚乙烯亞胺、氨水、(NH4)2SO4等均為市售生化試劑。

Bacillussp.YM55-1、E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、pET-28a(+)均保藏于本公司。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5、胰蛋白胨10、NaCl 10。

TB培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏24、胰蛋白胨12、甘油5、KH2PO42.31、K2HPO4·3H2O 16.43。

1.2 方法

1.2.1 天冬氨酸酶的克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中Bacillussp.YM55-1基因序列設(shè)計(jì)引物，正向引物F：5′-CGCGGATCCATGAATACCGATGTTCGT-3′，反向引物R：5′-CCGCTCGAGTATTTTCTTCCAGCAATTCCCGG-3′(下劃線部分分別為BamH Ⅰ和XhoⅠ的限制性酶切位點(diǎn))。挑取Bacillussp.YM55-1單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)14 h，5 000 r/min離心10 min收集菌體，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取Bacillussp.YM55-1基因組。以獲得的基因組為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到天冬氨酸酶基因AspB。擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒純化，與載體pET-28a(+)分別用BamHⅠ和XhoⅠ于37 ℃雙酶切2 h。酶切反應(yīng)液使用DNA清潔試劑盒純化后，取適量載體和基因片段，加入DNA連接酶混勻，于16 ℃連接反應(yīng)12 h。隨后加入到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，利用卡那霉素抗性篩選得到克隆菌株，測序驗(yàn)證得到重組質(zhì)粒pET-28a(+)-AspB。

設(shè)計(jì)天冬氨酸酶基因T187C、K324M和N326C定點(diǎn)突變所需引物，進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后使用DpnⅠ于37 ℃酶切3 h，隨后加入到E.coliDH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化液涂布在含有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基中。挑取單菌落至4 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜，抽提質(zhì)粒并送公司測序，確保突變基因正確。將得到的重組突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)，得到重組表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-AspBm。

1.2.2 天冬氨酸酶酶液制備

挑取重組表達(dá)菌株單菌落接種到含卡那霉素的4 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)14 h，按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種至200 mL TB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)，待OD600至0.6～0.8時(shí)加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，25 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h。菌液于5 000 r/min離心10 min，收集菌泥，用50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH 7.0)重懸2次后，加入50 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽，超聲波破碎(200～400 W，超聲3 s，間歇5 s，總共8 min)，在4 ℃條件下，8 000 r/min離心30 min收集上清液。

1.2.3 天冬氨酸酶活力測定

天冬氨酸酶酶活力的測定參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。1 mL反應(yīng)體系含50 mmol/L pH 7.0 HEPES緩沖液、0.1 mol/L L-天冬氨酸、100 μL適當(dāng)稀釋濃度的酶液。反應(yīng)體系于30 ℃反應(yīng)5 min，立即在240 nm處測定富馬酸吸光值的變化。

酶活定義：在30 ℃、pH 7.0條件下每分鐘生成1 μmol/L富馬酸所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位，1 U。

1.2.4 SDS-PAGE和蛋白含量測定

SDS-PAGE采用12%分離膠進(jìn)行電泳。蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行。

1.2.5 固定化細(xì)胞的制備

將180 mL水加入20 g菌體，充分?jǐn)嚢瑁傧蚓鷳乙褐屑尤?.2 g硅藻土和6 mL 5%聚乙烯亞胺，氨水調(diào)控pH至9.0，28 ℃充分?jǐn)嚢? h。隨后向溶液中加入2 mL 25%戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，維持pH在9.0左右，充分?jǐn)嚢? h后進(jìn)行抽濾，水淋洗2次，4 ℃儲存?zhèn)溆?。固定化?xì)胞前進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置不同量的硅藻土、聚乙烯亞胺和戊二醛，在上述參數(shù)下，天冬氨酸酶固定化細(xì)胞酶活最高。

1.2.6 天冬氨酸酶催化體系

催化體系為(g/L)巴豆酸185、MgSO42.4、(NH4)2SO458.8；氨水調(diào)pH至8.2。固定化天冬氨酸酶菌體量30 g/L，反應(yīng)溫度為40 ℃，反應(yīng)開始后氨水調(diào)控pH在8.9～9.1。

2 結(jié)果與討論

2.1 天冬氨酸酶在E.coli BL21(DE3)中的表達(dá)

重組表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，超聲波破碎后進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見圖2。由圖2可知，天冬氨酸酶大部分存在于上清液中，在分子量為(4.43～6.64)×104位置有明顯的表達(dá)條帶，與pET-28a(+)-AspBm理論5.16×104大小相近。

1—E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-AspBm IPTG誘導(dǎo)前樣；2—E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-AspBm破碎上清液；M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白

2.2 固定化細(xì)胞催化合成(R)-3-氨基丁酸的條件優(yōu)化

2.2.1 緩沖液pH對催化反應(yīng)的影響

圖3 緩沖液pH對反應(yīng)的影響

2.2.2 溫度對催化反應(yīng)的影響

保持其他反應(yīng)條件相同，設(shè)置不同反應(yīng)溫度，考察溫度對反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著溫度的升高，酶活得到逐步提高，在40 ℃達(dá)到最大。當(dāng)溫度提高到45 ℃時(shí)，相對酶活僅有85.7%，考慮可能是溫度過高導(dǎo)致天冬氨酸酶的穩(wěn)定性變差，從而使酶活變低。因此選擇40 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。

圖4 溫度對反應(yīng)的影響

2.2.3 菌體量對催化反應(yīng)的影響

保持其他反應(yīng)條件相同，設(shè)置不同反應(yīng)菌體量，考察菌體量對反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可見，(R)-3-氨基丁酸的質(zhì)量濃度隨著菌體量的增加而逐漸得到提高，在菌體量為30 g/L時(shí)，底物轉(zhuǎn)化接近99%，進(jìn)一步增加菌體量會對后續(xù)的產(chǎn)物分離造成一定的困難，同時(shí)也存在一定程度的浪費(fèi)，因此最佳菌體量選擇為30 g/L。

圖5 菌體量對反應(yīng)的影響

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間對催化反應(yīng)的影響

其他反應(yīng)條件不變，考察反應(yīng)時(shí)間對反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，產(chǎn)物質(zhì)量濃度得到不斷地提高。在反應(yīng)前16 h反應(yīng)速率較快，在22 h后產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增長變得更加緩慢，一方面可能是反應(yīng)時(shí)間過長，酶活力降低，另一方面可能是反應(yīng)達(dá)到平衡。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，反應(yīng)時(shí)間選擇在22 h。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對反應(yīng)的影響

2.2.5 固定化AspBm催化巴豆酸產(chǎn)(R)-3-氨基丁酸

巴豆酸經(jīng)固定化AspBm催化反應(yīng)22 h后，產(chǎn)物(R)-3-氨基丁酸收率為97.8%。利用HPLC分析反應(yīng)18 h和26 h的情況，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，反應(yīng)26 h轉(zhuǎn)化液幾乎已無巴豆酸殘留，反應(yīng)較為徹底。

圖7 固定化細(xì)胞催化巴豆酸反應(yīng)18和26 h的HPLC圖譜

2.2.6 重復(fù)使用次數(shù)

在上述最優(yōu)條件下進(jìn)行固定化細(xì)胞酶促反應(yīng)，每批次反應(yīng)結(jié)束后檢測(R)-3-氨基丁酸的質(zhì)量濃度，固定化細(xì)胞經(jīng)清洗后立即進(jìn)入下批次的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。固定化細(xì)胞重復(fù)使用次數(shù)的結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，固定化細(xì)胞可重復(fù)使用次數(shù)不低于24次，此時(shí)(R)-3-氨基丁酸的產(chǎn)率達(dá)到89.2%。隨著反應(yīng)批次的繼續(xù)增多，產(chǎn)率逐漸減小。

圖8 固定化細(xì)胞重復(fù)使用次數(shù)對反應(yīng)的影響

3 結(jié)論

從Bacillussp.YM55-1中克隆得到天冬氨酸酶基因，對其序列進(jìn)行分析，作定點(diǎn)突變，并利用大腸桿菌作為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)了Bacillussp.YM55-1 Asp基因的異源表達(dá)。將天冬氨酸酶基因工程菌制備成固定化細(xì)胞，考察不同反應(yīng)條件對天冬氨酸酶催化生成(R)-3-氨基丁酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：反應(yīng)緩沖液pH控制在9.0、反應(yīng)溫度40 ℃、反應(yīng)時(shí)間22 h、菌體量為30 g/L時(shí)，產(chǎn)物的質(zhì)量濃度能達(dá)到220 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%以上?；蚬こ叹潭ɑ?xì)胞多達(dá)24次的重復(fù)使用，使得工業(yè)化生產(chǎn)(R)-3-氨基丁酸的成本得到顯著降低。在本項(xiàng)目研究過程中，發(fā)現(xiàn)隨著底物巴豆酸質(zhì)量濃度的提高，天冬氨酸酶耐受性變差，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率隨之降低。倘若通過諸如一些分子生物學(xué)方面的技術(shù)來改造天冬氨酸酶，或許可以提高酶的穩(wěn)定性和酶活力，從而使工業(yè)化生產(chǎn)成本得到進(jìn)一步的降低，同時(shí)對于降低度魯特韋的售價(jià)也能起到一定的作用。