龍 娟，肖新生，唐珊珊，李 瑤，楊 寧

(湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 永州 425199)

以山茶油和甘油為原料進(jìn)行甘油解反應(yīng)，制備得到主要組分為甘油一酯(MAG)、甘油二酯(DAG)和甘油三酯(TAG)的混合物，進(jìn)一步分離后可以得到高純度的MAG、DAG和TAG。這些組分在食品中具有不同的功能，并得到廣泛的應(yīng)用。甘油解反應(yīng)進(jìn)行的程度對(duì)產(chǎn)物的組成具有重要的影響，而對(duì)反應(yīng)過(guò)程中各種甘油酯組成的快速測(cè)定是控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前監(jiān)控食用油甘油解反應(yīng)過(guò)程的主要方法有色譜法(柱層析法、高效液相色譜法[1-2]、氣相色譜法[3-4]和薄層色譜法[5-6])、質(zhì)譜法[7-8]、色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[9-10]和近紅外光譜技術(shù)[11]等，但這些方法具有操作煩瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)和污染環(huán)境等缺點(diǎn)，因此尋找快速簡(jiǎn)單的測(cè)定方法具有重要意義。

核磁共振技術(shù)(NMR)是基于原子核對(duì)射頻輻射所產(chǎn)生吸收的一種波譜技術(shù)，在物質(zhì)的定性定量分析方面有著廣泛的應(yīng)用[12]。某種特定的原子核在給定的外加磁場(chǎng)中只能吸收某一特定頻率，在核磁共振譜圖上具有特定的化學(xué)位移。由于山茶油MAG、DAG和TAG結(jié)構(gòu)的差異，導(dǎo)致其特定氫原子的化學(xué)位移有差異(特別是甘油骨架上的氫)。因此，利用NMR技術(shù)對(duì)山茶油甘油解制備甘油酯的反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控，對(duì)其產(chǎn)物中所含的甘油酯進(jìn)行定性以及定量分析是可行的。

本研究首先制備了純的山茶油MAG、1,2-DAG、1,3-DAG和TAG，然后采用NMR技術(shù)對(duì)純品進(jìn)行了氫譜分析，尋找各氫譜中特征峰并計(jì)算峰面積，總結(jié)MAG、1,2-DAG、1,3-DAG和TAG特征峰面積與甘油酯含量的關(guān)系，從而推導(dǎo)出甘油酯含量的計(jì)算公式。最后，利用建立的方法準(zhǔn)確監(jiān)控了山茶油甘油解過(guò)程中各組分含量的變化規(guī)律。本研究可為核磁共振法在其他反應(yīng)過(guò)程的應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山茶油，購(gòu)于永州市零陵區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。石油醚、正己烷、無(wú)水乙醚和甘油，分析純，購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)。氘代氯仿，分析純，購(gòu)于東京化成工業(yè)株式會(huì)社。2,7 -二氯熒光素，分析純，購(gòu)于上海翰思化工有限公司。甲醇鈉，分析純，購(gòu)于匯鑫化工有限責(zé)任公司。

Bruker Avance Ⅲ HD400型核磁共振波譜儀，RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，78-1型磁力攪拌器，SHB- Ⅲ A型循環(huán)水式真空泵，C381730C型具砂板存儲(chǔ)球?qū)游鲋?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山茶油甘油解反應(yīng)制備甘油酯

將88.4 g山茶油與4.6 g甘油(摩爾比2∶1)放入250 mL兩口燒瓶中，往燒瓶中加入1.78 g甲醇鈉(山茶油質(zhì)量的2%)作為反應(yīng)的催化劑，并在瓶中放入四氟磁力攪拌子一粒，在兩口燒瓶的其中一個(gè)接口裝上磁力攪拌器的溫控探頭，另外一個(gè)接口接尾氣收集裝置。將兩口燒瓶放入150℃的磁力攪拌器中加熱反應(yīng)。從反應(yīng)開(kāi)始后的0、10、30、50、70、90、110、130、150 min分別取2 mL的反應(yīng)產(chǎn)物待測(cè)。

山茶油與甘油底物摩爾比1∶2的反應(yīng)將甘油的質(zhì)量從4.6 g調(diào)整為18.4 g，其余條件不變。從反應(yīng)開(kāi)始后的0、20、40、60、80、100、120、150 min分別取2 mL的反應(yīng)產(chǎn)物待測(cè)。

1.2.2 柱層析法分離產(chǎn)物

向C381730C型具砂板存儲(chǔ)球?qū)游鲋屑尤牍枘z石油醚溶液(150 mL石油醚+60 g硅膠)，加壓壓緊后，加入1 g樣品。首先用石油醚進(jìn)行洗脫，以2,7-二氯熒光素為顯色劑，采用TLC監(jiān)測(cè)產(chǎn)物點(diǎn)，石油醚洗脫出來(lái)的點(diǎn)為T(mén)AG。收集完TAG后，改用石油醚-乙醚-甲酸(體積比70∶30∶1)為洗脫劑，分別得到1,3-DAG和1,2-DAG。收集完成上述兩個(gè)點(diǎn)后，改用乙醚-甲酸(體積比100∶2)進(jìn)行洗脫，得到MAG。收集得到的各點(diǎn)分別脫除溶劑后即得到山茶油MAG、1,2-DAG、1,3-DAG和TAG的純品。將4個(gè)樣品分別稱(chēng)重，計(jì)算各個(gè)組分的相對(duì)含量。

1.2.3 核磁共振法分析

將純化得到的MAG、1,2-DAG、1,3-DAG、TAG及甘油解反應(yīng)液各取10 mg，用0.5 mL氘代氯仿溶解，將溶解的樣品轉(zhuǎn)移至核磁管中，用Bruker Avance III HD400型核磁共振波譜儀，選擇氫譜掃描16次，即得樣品的氫譜圖。將得到的譜圖采用MestReNova軟件進(jìn)行分析，整理數(shù)據(jù)信息。MAG、1,2-DAG、1,3-DAG、TAG樣品特征峰的化學(xué)位移(δ)分別為3.92、5.09、4.09、5.27，以端甲基(化學(xué)位移(δ)為0.88)峰面積300為參考，計(jì)算各峰面積與含量的校正系數(shù)。進(jìn)而根據(jù)未知樣品中各特征峰的面積，利用校正系數(shù)可計(jì)算各組分的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 山茶油甘油酯的核磁共振譜圖分析

通過(guò)柱層析法分離后得到的樣品，采用Bruker Avance III HD400型核磁共振波譜儀掃描即可得到氫譜圖(1H NMR譜)，見(jiàn)圖1。將所得譜圖用MestReNova軟件進(jìn)行分析，對(duì)1H NMR譜圖中的各個(gè)特征峰進(jìn)行積分并計(jì)算峰面積。將1H NMR譜圖局部放大進(jìn)行分析，見(jiàn)圖2。

由圖1可知，山茶油各甘油酯的化學(xué)位移(δ)0～2.5 的吸收峰是基本一致的，對(duì)δ0～2.5的各個(gè)峰進(jìn)行積分發(fā)現(xiàn)其峰面積一致。位于最右側(cè)的δ0.88 的峰是由脂肪酸的端甲基產(chǎn)生的吸收峰，該峰出現(xiàn)的位置以及對(duì)該峰進(jìn)行積分所得到的峰面積最穩(wěn)定，因此將此峰的峰面積賦值為300，以其為基準(zhǔn)峰對(duì)各甘油酯的特征峰進(jìn)行積分。對(duì)1H NMR譜圖中的δ2.5～5.5進(jìn)行分析，MAG、1,2-DAG、1,3-DAG和TAG的特征峰的化學(xué)位移(δ)分別為3.92、5.09、4.09、5.27。在本反應(yīng)產(chǎn)物中雜質(zhì)含量微小可忽略不計(jì)，所以總含量可視為MAG、1,2-DAG、1,3-DAG和TAG的含量之和。

圖1 各甘油酯的1H NMR譜圖

從圖2可以直觀(guān)看出MAG、1,2-DAG、1,3-DAG和TAG的特征峰的位置。對(duì)甘油一酯的1H NMR譜進(jìn)行分析，脂肪酸端甲基所形成的吸收峰的化學(xué)位移(δ)為0.88(即A峰)，以其為基準(zhǔn)對(duì)峰面積賦值為300，對(duì)MAG的特征峰進(jìn)行積分并計(jì)算其峰面積，得到特征峰(即B峰)的δ為3.92，峰面積為 88.69。通過(guò)與1,2-DAG、1,3-DAG和TAG的1H NMR譜進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在1,2-DAG、1,3-DAG和TAG的譜圖中δ3.92處不存在吸收峰。對(duì)1,2-DAG的1H NMR譜進(jìn)行分析，以脂肪酸端甲基所形成的吸收峰為基準(zhǔn)對(duì)峰面積賦值為300，再對(duì)1,2-DAG的特征峰積分并計(jì)算其峰面積，得特征峰(即B峰)的δ為5.09，峰面積為42.11。通過(guò)與MAG、1,3-DAG和TAG的1H NMR譜對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其他1H NMR譜的δ5.09處不存在吸收峰。對(duì)此現(xiàn)象進(jìn)行分析，假設(shè)該處的特征峰峰面積隨著1,2-DAG含量的增大而增大。對(duì)1,3-DAG的1H NMR譜解析，計(jì)算其特征峰的峰面積，以δ0.88的端甲基上的H所產(chǎn)生的吸收峰為基準(zhǔn)，對(duì)其賦值300為標(biāo)準(zhǔn)值，對(duì)1,3-DAG的特征峰進(jìn)行積分并計(jì)算其峰面積，得到特征峰的δ為4.09，峰面積為27.26。與MAG、1,2-DAG和TAG的1H NMR譜比對(duì)，雖然在其特征峰附近存在吸收峰，但吸收峰并未重疊，且該處的特征峰的化學(xué)位移在另外的1H NMR譜中沒(méi)有吸收峰，這一發(fā)現(xiàn)證明了前面的推測(cè)，只有當(dāng)存在某一甘油酯時(shí)，才會(huì)在該甘油酯的特征峰位移處產(chǎn)生一定的吸收峰，即特征峰的峰面積隨著其含量的改變而改變。同樣，以脂肪酸端甲基所形成的吸收峰為基準(zhǔn)對(duì)峰面積賦值為300，對(duì)TAG的特征峰進(jìn)行積分，得到其特征峰的δ為5.27，峰面積為36.74。對(duì)比MAG、1,2-DAG和1,3-DAG的1H NMR譜，δ5.27處沒(méi)有明顯的吸收峰，且該處的峰面積為0，因此在甘油三酯特征峰位置為δ5.27處的峰面積較大的時(shí)候，其他的譜圖中在該位置所產(chǎn)生的吸收峰對(duì)結(jié)果的影響不大。經(jīng)過(guò)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)MAG、1,2-DAG、1,3-DAG和TAG的特征峰的峰面積均在其為純甘油酯的時(shí)候有一個(gè)最大值。

通過(guò)以上分析，本研究做出以下推測(cè)：假如所測(cè)樣品中全部組分都是TAG時(shí)，其特征峰的峰面積為36.74；對(duì)比其他甘油酯的1H NMR譜，對(duì)化學(xué)位移相等的位置進(jìn)行積分時(shí)，其他1H NMR譜中得到的峰面積為0 ，則反應(yīng)體系中的TAG特征峰峰面積的取值范圍為0～36.74，即峰面積的值越靠近36.74時(shí)，體系中TAG的含量越多。同理，可得到關(guān)于MAG、1,2-DAG和1,3-DAG含量變化的預(yù)測(cè)。針對(duì)上述推測(cè)，本研究將通過(guò)同時(shí)采用核磁共振法和柱層析法計(jì)算分離后的各個(gè)組分在未知樣中的含量，將采用兩種方法分別重復(fù)5次試驗(yàn)所得到的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證兩方法是否存在明顯的差異。

2.2 核磁共振法計(jì)算各甘油酯含量

2.2.1 甘油酯含量的推導(dǎo)

將圖1和圖2進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)MAG在δ3.92處存在吸收峰，在1,2-DAG、1,3-DAG和TAG的1H NMR譜該化學(xué)位移處不存在吸收峰。同理對(duì)1,2-DAG、1,3-DAG和TAG的特征峰進(jìn)行分析，其特征峰δ值分別為5.09、4.09和5.27 ，依次分析1,2-DAG、1,3-DAG和TAG的特征峰的情況，在除本身之外的圖譜中，同一化學(xué)位移處均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)吸收峰。以脂肪酸端甲基所形成的吸收峰為基準(zhǔn)對(duì)峰面積賦值為300，對(duì)其他譜圖進(jìn)行積分得到特征峰的峰面積，見(jiàn)表1。

表1 特征峰峰面積

針對(duì)甘油酯的特征峰的峰面積會(huì)隨著甘油酯含量的變化而變化這一推測(cè)，再根據(jù)各甘油酯的1H NMR譜的實(shí)際情況可做出推斷：甘油酯的含量與特征峰的峰面積呈正比，由此推導(dǎo)出相應(yīng)的關(guān)系式如下。

式中：S為特征峰的峰面積；δ為1H NMR譜中的化學(xué)位移。

2.2.2 甘油酯含量計(jì)算

取甘油解反應(yīng)液樣品10 mg，用0.5 mL氘代氯仿溶解，將溶解的樣品轉(zhuǎn)移至核磁管中，用Bruker Avance III HD400型核磁共振波譜儀，選擇氫譜掃描16次，即得樣品的氫譜圖，見(jiàn)圖3。經(jīng)過(guò)對(duì)1H NMR譜進(jìn)行積分，得到特征峰的峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖3 未知樣中甘油酯各組分的特征峰

表2 150 min時(shí)1H NMR譜特征峰峰面積

將表2中的結(jié)果帶入2.2.1中的公式，得到各甘油酯的含量，見(jiàn)表3。

表3 150 min時(shí)各甘油酯含量

2.3 柱層析法計(jì)算各甘油酯含量

取甘油解反應(yīng)液樣品(與采用核磁共振法的甘油解反應(yīng)液樣品相同)1.0 g ，采用柱層析法分離得到山茶油MAG、1,2-DAG、1,3-DAG和TAG的純品。將4個(gè)樣品分別稱(chēng)重并計(jì)算各個(gè)組分的相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表4、表5。

表4 柱層析法測(cè)得各甘油酯質(zhì)量

表5 柱層析法各甘油酯相對(duì)含量

2.4 兩種方法的方差分析

利用單因素方差分析對(duì)核磁共振法和柱層析法進(jìn)行比較分析，結(jié)果如表6～表9所示。

表6 MAG方差分析結(jié)果

表7 1,2-DAG方差分析結(jié)果

表8 1,3-DAG方差分析結(jié)果

表9 TAG方差分析結(jié)果

通過(guò)方差分析的特性，當(dāng)F>Fcrit 時(shí)，存在差異，此時(shí)再比較P值，若0.01

從表6～表9可知，所有組分(MAG、1,2 -DAG、1,3-DAG和TAG)經(jīng)方差分析計(jì)算得到的F值均小于Fcrit 值，P值均大于0.05 ，因此核磁共振法和柱層析法無(wú)顯著性差異。

2.5 山茶油甘油解反應(yīng)過(guò)程監(jiān)控

2.5.1 山茶油與甘油摩爾比1∶2時(shí)的甘油解反應(yīng)過(guò)程監(jiān)控

將88.4 g山茶油與18.4 g甘油(摩爾比1∶2)反應(yīng)，從反應(yīng)開(kāi)始后的0、20、40、60、80、100、120、150 min分別取2 mL的反應(yīng)產(chǎn)物，使用Bruker Avance III HD400型核磁共振波譜儀得到氫譜圖，將得到的譜圖采用MestReNova軟件進(jìn)行分析，計(jì)算特征峰的峰面積，將其峰面積帶入2.2.1中的公式中，得到不同反應(yīng)時(shí)間的MAG、1,2-DAG、1,3-DAG、TAG含量，結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 山茶油與甘油摩爾比1∶2時(shí)不同反應(yīng)時(shí)間的甘油酯含量

由表10可以看出：在反應(yīng)開(kāi)始后的0～20 min、40～80 min和120～150 min，反應(yīng)相對(duì)比較緩慢，反應(yīng)過(guò)程中有兩次比較劇烈的變化，第一次是在20～40 min，生成了較多的1,3-DAG，TAG減少得較快，第二次是在80～120 min時(shí)，此時(shí)TAG的含量大幅減少，其余甘油酯含量大幅增多，然后反應(yīng)進(jìn)入平衡狀態(tài)。 甘油解反應(yīng)是一種可逆反應(yīng)，在反應(yīng)進(jìn)行到120 min后基本進(jìn)入平衡狀態(tài)，此時(shí)各個(gè)組分的含量變化不大。

2.5.2 山茶油與甘油摩爾比2∶1時(shí)的甘油解反應(yīng)過(guò)程監(jiān)控

將88.4 g山茶油與4.6 g甘油(摩爾比2∶1)反應(yīng)，從反應(yīng)開(kāi)始后的0、10、30、50、70、90、110、130、150 min分別取2 mL的反應(yīng)產(chǎn)物,使用Bruker Avance III HD400型核磁共振波譜儀得到氫譜圖，將得到的譜圖采用MestReNova軟件進(jìn)行分析，計(jì)算特征峰的峰面積，將其峰面積帶入2.2.1中的公式，得到不同反應(yīng)時(shí)間的MAG、1,2-DAG、1,3-DAG、TAG含量，結(jié)果見(jiàn)表11。

由表11可以看出，在此反應(yīng)過(guò)程中，TAG含量從100%減少到38.10%，與以山茶油與甘油摩爾比1∶2進(jìn)行反應(yīng)的結(jié)果相比較，減少幅度更大。從化學(xué)反應(yīng)的角度來(lái)看，2 mol的甘油三酯與1 mol的甘油完全反應(yīng)可以得到2 mol的甘油二酯，因?yàn)楦视徒夥磻?yīng)為可逆反應(yīng)，在反應(yīng)達(dá)到一定程度之后會(huì)趨于平衡。

表11 山茶油與甘油摩爾比2∶1時(shí)不同反應(yīng)時(shí)間的甘油酯含量

對(duì)比山茶油與甘油摩爾比為1∶2和2∶1的甘油解反應(yīng)，共同點(diǎn)有：反應(yīng)到達(dá)一定時(shí)間后可逆反應(yīng)就趨于平衡。這兩個(gè)反應(yīng)過(guò)程中的不同點(diǎn)有：①后者的反應(yīng)程度大于前者的反應(yīng)程度，即山茶油與甘油摩爾比為2∶1的反應(yīng)中1,3-DAG的含量更多，TAG含量更少；②反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，前者的MAG和1,2-DAG含量較后者的多。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)山茶油甘油一酯、1,2-甘油二酯、1,3-甘油二酯和甘油三酯純品的核磁共振氫譜分析，可以找到各自的特征峰，其化學(xué)位移(δ)分別為3.92、5.09、4.09 和 5.27，其相對(duì)峰面積分別為88.69、42.11、27.26和36.74，進(jìn)而推導(dǎo)出未知樣甘油酯含量的計(jì)算方法。將相同甘油解產(chǎn)物分別采用柱層析法和核磁共振法進(jìn)行分析測(cè)定，通過(guò)方差分析發(fā)現(xiàn)兩種方法測(cè)定的結(jié)果沒(méi)有顯著性差異，即利用NMR技術(shù)對(duì)山茶油甘油解制備甘油酯的反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控，對(duì)其產(chǎn)物中所含的甘油酯進(jìn)行定量分析是可行的。同時(shí)，本研究利用建立的方法準(zhǔn)確監(jiān)控了山茶油甘油解過(guò)程中各組分的含量變化規(guī)律。核磁共振法監(jiān)控山茶油甘油解反應(yīng)過(guò)程中各個(gè)組分的含量具有快速、準(zhǔn)確和環(huán)保等特點(diǎn)，值得采用并推廣到其他合成反應(yīng)中。