程 洋，韋 偉，金青哲，王興國

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

姜黃素因存在于姜黃中而得名，是目前世界上銷量最大的天然食用色素之一，被世界衛(wèi)生組織及美國食品藥品管理局等多個組織列為準(zhǔn)許使用的食品添加劑。除此之外，姜黃素因具有抗癌、抗炎、抗氧化等功能[1-3]，被醫(yī)學(xué)研究廣泛關(guān)注。細(xì)胞毒性實驗表明，姜黃素可以被人類安全攝入[4]，但是其低水溶性[5]、易氧化、中/堿性環(huán)境下不穩(wěn)定及對腸部細(xì)胞低滲透性[6]等缺陷限制了其作為生物活性物質(zhì)在食品、藥品領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，現(xiàn)在主要面臨的挑戰(zhàn)是保護這類具備多重功能的生物活性物質(zhì)免遭不利因素的影響并增加其生理益處。

納米載體能夠有效提升藥物生物活性、控制藥物釋放并抑制藥物副作用，成為了目前醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點。納米載運系統(tǒng)[7]被越來越多地參與危重病癥的治療，尤其是對于腫瘤、癌癥這類致病機理復(fù)雜的病癥，智能性納米載體可有效抵達靶向區(qū)域，有針對性地輔助治療。目前納米載藥材料以多聚物居多，主要包括多糖、蛋白質(zhì)等，這些物質(zhì)結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，賦予納米載藥體表面更多修飾位點，以期提供更為智能的靶向載運效果。但復(fù)雜的結(jié)構(gòu)也導(dǎo)致其合成、純化等生產(chǎn)過程相對困難，尤其是對多聚物聚集程度進行有效控制是一大難題[8]，除此之外，多聚物自身毒理性缺陷也成為了多聚物納米顆粒應(yīng)用受限的一大阻礙[9]。

本研究以具有高生物相容性的脂肪酸糖醇單酯為脂質(zhì)納米載體制備原料，包載疏水性模型藥物姜黃素，在此過程中探究載體在包埋藥物前后粒徑、表面電勢變化，進行形態(tài)學(xué)表征，利用體外消化系統(tǒng)，探索消化過程中該材料包載姜黃素的變化，同時利用體外釋放實驗研究脂質(zhì)納米載體的溫敏性，分析其作為納米載體在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用空間。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

月桂酸乙二醇單酯(純度>95%)、肉豆蔻酸赤蘚糖醇單酯(純度>95%)，經(jīng)酶法合成、純化得到；姜黃素(純度97%)，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胃蛋白酶、胰脂酶及膽汁鹽，購自上海百靈威科技有限公司；氯化鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、六水合氯化鎂、氯化鈉、碳酸銨、鹽酸及二水合氯化鈣，均購自上海國藥集團試劑有限公司；實驗用水通過Milli-Q系統(tǒng)(Millipore，MA)過濾得到。

1.1.2 儀器與設(shè)備

JY92-llN型超聲波細(xì)胞粉碎機，多角度粒徑與高靈敏度Zeta電位分析儀(美國布魯克海文儀器公司)，TGL-16B高速臺式離心機，T-6V型可見分光光度計，F(xiàn)E20型pH計，S-1型水浴搖床，XW-80A型旋渦混合器，BQ 100-1A型蠕動泵驅(qū)動器。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂質(zhì)納米載體的制備

脂質(zhì)納米載體的制備在Wei等[10]的方法基礎(chǔ)上稍作調(diào)整。將0.4 mg姜黃素與10 mg脂肪酸糖醇單酯(質(zhì)量比90∶10的肉豆蔻酸赤蘚糖醇單酯和月桂酸乙二醇單酯復(fù)配物)在高于脂肪酸糖醇單酯熔點5℃的溫度下熔化，并加至10 mL冷水中，通過1 000 r/min磁力攪拌5 min的方式加速其在水中的分散進而初步形成水包油(O/W)型乳液。然后利用超聲波細(xì)胞粉碎機在20 kHz、500 W條件下進行超聲從而進一步促進分散。超聲過程中每10 s暫停2 s，重復(fù)3次，共超聲30 s，得到包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體乳液。

1.2.2 粒徑及表面電勢測定

樣品乳液的粒徑和表面電勢均利用多角度粒徑與高靈敏度Zeta電位分析儀測定。在粒徑測定模式下，將25℃、173°入射光作為測定條件，將乳液樣品放入比色皿置于儀器中進行檢測。在表面電勢(Zeta電位)測定模式下，利用pH 7.4緩沖液進行適當(dāng)?shù)臐舛日{(diào)整，乳液樣品被放入比色皿并插上電極置于儀器中測定。粒徑及表面電勢至少測定3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

1.2.3 姜黃素含量的測定

模型藥物姜黃素含量的測定參考Wei[10]、Tan[11]等的方法并在此基礎(chǔ)之上進行調(diào)整。取1 mL脂質(zhì)納米載體乳液至1.5 mL EP管中，12 000 r/min高速離心5 min以分離納米載體。取上清液加入5 mL 二氯甲烷并旋渦振蕩2 min，靜置至水相與有機相完全分開，取下層包含姜黃素的有機相利用乙醇進行適當(dāng)稀釋，在波長422 nm下利用可見分光光度計測定吸光度，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.078 46x，R2=0.999 94，其中y表示吸光度，x表示姜黃素質(zhì)量濃度)計算姜黃素含量。 每個樣品至少測定3次，結(jié)果以平均值表示。按下式計算脂質(zhì)納米載體包載藥物的包載率及姜黃素釋放率。

式中：藥物總量為包載藥物的載體制備過程中加入的姜黃素質(zhì)量，0.4 mg；剩余藥物量為載體制備后乳液體系中游離的姜黃素質(zhì)量，mg；藥物釋放量為釋放過程中乳液體系中游離的姜黃素的質(zhì)量，mg。

1.2.4 形態(tài)學(xué)表征

1.2.4.1 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察

將質(zhì)量濃度為1 mg/mL、體積為5 μL的包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體乳液滴于錫箔紙光面部分，利用雙面導(dǎo)電膠將錫箔紙固定在托盤上，放置在真空干燥器中過夜干燥。樣品鍍金后利用SU8100型冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察。觀察條件：二次電子檢測器加速電壓5 kV，距離4～5 mm。

1.2.4.2 原子力顯微鏡(AFM)觀察

將質(zhì)量濃度為10 μg/mL的包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體乳液滴于剛剛剝離的云母片表面，并放于空氣中自然干燥過夜。利用Dimension ICON型原子力顯微鏡進行觀察。觀察條件：掃描頻率1 Hz，分辨率512像素×512像素，掃描尺寸300 nm×300 nm；每個樣品在不同位置進行觀察以保證重復(fù)性。

1.2.5 體外釋放實驗

脂質(zhì)納米載體的體外釋放實驗參考Wei等[10]的方法，并在此基礎(chǔ)上進行調(diào)整，實驗分別在4、25、37℃及42℃下進行。將新鮮制備的7.5 mL包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體與等體積的1%SDS溶液加入玻璃試管中，置于指定溫度下的搖床中，轉(zhuǎn)速設(shè)置為240 r/min，分別于15、30、60、120、240 min取樣500 μL，在12 500 r/min下離心5 min，取上清液測定其中姜黃素含量，并計算釋放率。

1.2.6 體外模擬消化

利用體外模擬消化實驗，研究包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體在進入消化道后的變化。體外模擬消化模型參考文獻[12]，并在其基礎(chǔ)上稍作調(diào)整。根據(jù)Minekus等[13]的方法配制模擬口腔消化液(Simulated saliva fluid，SSF)、模擬胃消化液(Simulated gastric fluid，SGF)及模擬小腸消化液(Simulated intestinal fluid，SIF)，具體見表1。

表1 模擬消化液的制備

1.2.6.1 口腔消化

向50 mL樣品乳液中加入10 mL SSF，預(yù)熱至37℃，并以100 r/min恒溫攪拌10 s，以模擬口腔消化[14]。

1.2.6.2 胃部消化

將60 mL口腔消化產(chǎn)物(50 mL包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體+10 mL SSF)排入預(yù)留有12 mL SGF的胃部反應(yīng)容器進行消化，在消化過程中維持胃部環(huán)境pH為2，具體流速條件見表2。分別于反應(yīng)5、15、30、60 min及90 min取樣1 mL，對所取樣品按1.2.3操作(不需分離納米載體)測定姜黃素含量，并計算姜黃素釋放率。

表2 胃部模擬消化過程流速控制條件

1.2.6.3 腸部消化

將200 mL胃部消化產(chǎn)物(乳液與SSF、SGF混合物)排入預(yù)留有36 mL SIF的腸部反應(yīng)器進行進一步消化，消化過程中維持pH為7，具體腸部消化液流速條件見表3。分別于反應(yīng)5、10、30、69、90 min及120 min取樣1 mL，對所取樣品進行姜黃素含量的測定。

表3 腸部模擬消化過程流速控制條件

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)利用Origin 9和IBM SPSS Statistics 25軟件進行數(shù)據(jù)處理并分析作圖。以p<0.01為差異極顯著，p<0.05為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂質(zhì)納米載體粒徑與表面電勢

將經(jīng)溶解-超聲法得到的空脂質(zhì)納米載體、包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體及姜黃素溶于乙醇溶液，發(fā)現(xiàn)均無可見顆粒，且都均一穩(wěn)定存在?？罩|(zhì)納米載體無色澄清，包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體呈透明的淡黃色，顏色較姜黃素自身顏色淺，這一點直觀證明了脂質(zhì)納米載體對于姜黃素的包載具有一定效果。

利用多角度粒經(jīng)與高靈敏度Zeta電位分析儀對空脂質(zhì)納米載體和包載4%姜黃素的脂質(zhì)納米載體進行粒徑及表面電勢表征，結(jié)果見表4。

表4 脂質(zhì)納米載體粒徑及表面電勢

由表4可見，脂質(zhì)納米載體包載姜黃素后，粒徑由250.63 nm增加到265.42 nm，PDI由0.29增加至0.30，Zeta電位由 -39.87 mV變?yōu)?45.44 mV，粒徑大小、分布及表面電勢絕對值均略微增加，并未因包載姜黃素而發(fā)生顯著性變化，這表明在利用溶解-超聲法制備包埋姜黃素的脂質(zhì)納米載體過程中，兩種脂肪酸糖醇單酯與姜黃素相互混合均勻，并結(jié)合緊密，在水相中達到了較好的親水親脂性平衡。當(dāng)脂肪酸糖醇單酯進入水中后，由于具備特別的兩親結(jié)構(gòu)而發(fā)生自組裝，使得親水性糖醇頭基端朝向外部水相，脂肪?；顺騼?nèi)部成疏水性空間，同屬疏水性的姜黃素與脂肪酰基端通過疏水力的相互作用結(jié)合填補了內(nèi)部疏水性空間，進而使包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體較原空脂質(zhì)納米載體粒徑稍大。

在包載前后表面電勢均呈負(fù)電，表明脂肪酸糖醇單酯的糖醇頭基端對脂質(zhì)納米載體的制備產(chǎn)生很大影響，這一點同Wei等[10]的研究結(jié)果一致，而Zeta電位絕對值的增加表明疏水性藥物與原有空脂質(zhì)納米載體的有機結(jié)合，提高了體系的穩(wěn)定性。脂肪酸糖醇單酯作為脂質(zhì)納米載體包載姜黃素得到的包載率為94.60%，高于Tan等[11]包載姜黃素的研究結(jié)果，表明本研究包載結(jié)果較優(yōu)，這一點同粒徑和電位結(jié)果相符。

2.2 脂質(zhì)納米載體形態(tài)

利用SEM對包載4%姜黃素的脂質(zhì)納米載體進行形態(tài)學(xué)表征，結(jié)果見圖1。

圖1 包載姜黃素脂質(zhì)納米載體的SEM圖

由圖1可見，包載姜黃素脂質(zhì)納米載體為分布均勻的較小納米顆粒(箭頭處)，粒徑大小與分布情況同表4測定結(jié)果一致。顆粒呈圓形，具有較為光滑的表面。由于脂質(zhì)自身不導(dǎo)電，在測試時對樣品表面噴金，但噴金厚度可能在一定程度上改變樣品表面形態(tài)，影響表征結(jié)果，使測定結(jié)果無法呈現(xiàn)樣品表面原貌。因此，又采用了AFM進行觀測，結(jié)果見圖2。

圖2 包載姜黃素脂質(zhì)納米載體的AFM圖

與SEM相比，AFM前處理更方便，只需隔夜自然風(fēng)干與環(huán)境達到濕度飽和，即可進行觀測，無需噴金，不會對樣品表面形態(tài)造成改變。同時，不僅可以提供二維圖，還能夠提供粒子高度的信息。由圖2(a)可見，顆粒為均勻的圓形，粒徑大小及分布與表4測定結(jié)果一致，這一點由3D圖(圖2(b))也可清晰看出。圖2(c)顯示了其代表性顆粒高度為7.97 nm，說明包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體直徑(265.42 nm)遠(yuǎn)大于高度，表明顆粒在云母表面以扁平的圓盤狀存在。脂質(zhì)納米顆粒雖然在云母片表面結(jié)構(gòu)不會發(fā)生變化，但由于與環(huán)境存在濕度差而導(dǎo)致內(nèi)部水分蒸發(fā)，發(fā)生塌陷形成了圓盤狀粒子[15]。

2.3 脂質(zhì)納米載體在體外釋放過程中的變化

將包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體分別置于4、25、37℃及42℃搖床中，研究不同溫度下姜黃素釋放率隨時間的變化情況，結(jié)果見圖3。

圖3 不同溫度下包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體藥物釋放率

由圖3可見，包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體在4種溫度環(huán)境下，釋放率均呈現(xiàn)先快速增加后趨于平穩(wěn)的趨勢。其中在4℃反應(yīng)體系中，姜黃素釋放率在實驗開始15 min后達到2.14%，之后基本不變；在25℃下，姜黃素釋放率在實驗開始30 min后達到29.92%，之后基本穩(wěn)定；在37℃及42℃下，姜黃素釋放率在開始15 min后達到96%左右，之后基本穩(wěn)定。隨著溫度的升高姜黃素的釋放率呈現(xiàn)升高趨勢，在37、42℃下，姜黃素的釋放率顯著高于其他兩種溫度環(huán)境，且釋放率達到98%以上，這證明了脂質(zhì)納米載體具備高于37℃的溫度敏感性。對于37℃的敏感性被認(rèn)為對生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用十分重要[16]，證明了制備的脂質(zhì)納米載體在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。

2.4 脂質(zhì)納米載體在體外模擬消化過程中的變化

在本研究中，脂質(zhì)納米載體呈液態(tài)，不同于固態(tài)樣品在消化初期具備咀嚼過程，且不會在口腔中長期逗留，同時結(jié)合文獻[17]可知，口腔并不是脂質(zhì)體主要的釋放場所，原因在于其不具備特定酶活性且消化持續(xù)時間短。但這些并不能排除口腔消化液對胃腸部消化過程產(chǎn)生影響，因而僅進行口腔消化步驟并未取樣。

通過姜黃素釋放率及含量分別反映包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體在胃部及腸部釋放過程中的變化，結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體在胃部的藥物釋放率

由圖4可知，包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體進入胃部后即發(fā)生了藥物釋放，且釋放速率較高。僅5 min姜黃素釋放率就達到92.53%，隨著消化過程的繼續(xù)，釋放率繼續(xù)升高，15 min后達到97.81%，隨后趨于穩(wěn)定。這一點同其他包載藥物的納米載體在胃部消化過程中呈現(xiàn)的現(xiàn)象不同[18]，它們往往能夠保證藥物在胃部以包載形式存在，但釋放率較低。同樣以姜黃素為包載對象，Tan等[11]以多糖為納米載體材料研究姜黃素在消化過程中的釋放情況，結(jié)果其在胃部的釋放率僅為16%，這同本實驗結(jié)果差異較大，主要在于本研究制備的脂質(zhì)納米載體的較高臨界溶解溫度(UCST)為37℃。當(dāng)溫度低于37℃時，載體材料脂肪酸糖醇單酯因自身相對分子質(zhì)量較小且具備疏水基團而在分子內(nèi)部發(fā)生締合現(xiàn)象[19]，因而形成不溶于水的納米顆粒；當(dāng)脂質(zhì)納米載體進入37℃的模擬環(huán)境后，脂肪酸糖醇單酯的糖醇部多羥基結(jié)構(gòu)受熱而展開，與水結(jié)合形成分子間氫鍵促使分子內(nèi)發(fā)生解締合現(xiàn)象，進而溶于水，致使姜黃素直接暴露，釋放率升高。胃部為強酸環(huán)境，且不存在脂類水解酶，因此姜黃素能夠穩(wěn)定存在[20]，并未發(fā)生分解。

圖5 包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體在腸部的藥物含量變化

包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體經(jīng)過模擬胃部消化后進入模擬小腸繼續(xù)消化。由圖5可知，在進入腸道消化前姜黃素含量為98.63%，但在消化30 min后便基本分解殆盡。這一現(xiàn)象表明腸部是姜黃素的主要分解場所。腸部在酶種類、離子強度及pH等環(huán)境因素方面與胃部差異很大，接近中性的pH致使姜黃素?zé)o法穩(wěn)定存在而分解成阿魏酸和阿魏酰甲烷[6]；胰脂酶會促進水解；膽汁鹽則在消化過程中輔助氧化分解[21]。

3 結(jié) 論

以質(zhì)量比90∶10的肉豆蔻酸赤蘚糖醇單酯和月桂酸乙二醇單酯復(fù)配物為原料，制得粒徑(265.42 nm)較小、分布均勻(PDI為0.30)的包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體，其包載效果優(yōu)良，包裁率為94.60%。SEM與AFM形態(tài)學(xué)表征結(jié)果與粒徑分析儀分析結(jié)果一致；體外消化實驗表明，在胃部消化過程中，姜黃素釋放率快速上升，15 min達到97.81%，而小腸是姜黃素的主要分解場所；體外釋放實驗證明了包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體具備對37℃的溫度敏感性，表明制備的包載姜黃素的脂質(zhì)納米載體在醫(yī)藥領(lǐng)域具備很大的應(yīng)用空間。