楊 曦，程 群，常陸望，王振興，張雪春,，孫 健

(1.西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，昆明650224； 2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，南寧530007)

美藤果(PlukenetiavolubilisL.)是大戟科油料植物，生長(zhǎng)于亞馬遜森林，并作為秘魯土著部落的主食來(lái)源被廣泛種植[1]，現(xiàn)今在我國(guó)云南省部分地區(qū)已有種植基地[2]。自2013年美藤果被批準(zhǔn)為我國(guó)新食品原料以來(lái)，逐漸在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域呈現(xiàn)較好的開發(fā)前景。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)美藤果油的研究居多[1,3-4]，而對(duì)美藤果蛋白方面的研究較少，且主要集中在美藤果蛋白提取工藝、功能性質(zhì)和產(chǎn)品開發(fā)方面，如劉祥龍[5]、謝藍(lán)華[6]等研究了美藤果蛋白的提取工藝，張雪春等[7]研究了pH等因素對(duì)美藤果蛋白功能性質(zhì)的影響，杜冰等[8]開發(fā)了美藤果蛋白營(yíng)養(yǎng)酸奶。美藤果油中不飽和脂肪酸含量占93.71%[2]，美藤果極易受其不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)物的影響如自由基的誘導(dǎo)，導(dǎo)致美藤果中蛋白質(zhì)肽鍵斷裂、羰基化、分子間二硫鍵的形成等[9]，并使美藤果蛋白的溶解性、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)發(fā)生變化，從而影響美藤果的食用品質(zhì)與安全。

蛋白質(zhì)氧化常發(fā)生于富含蛋白質(zhì)的食物中，并可參與整個(gè)加工過(guò)程，甚至從初級(jí)加工到腸道消化，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被自由基誘導(dǎo)后可引起結(jié)構(gòu)上的共價(jià)修飾，這些修飾可能會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生負(fù)面影響[10-11]。植物蛋白受自由基誘導(dǎo)氧化的研究已有一些相關(guān)報(bào)道，如羥自由基氧化可影響大豆分離蛋白理化特性和凝膠特性[12]，過(guò)氧自由基和丙二醛氧化可影響米糠蛋白結(jié)構(gòu)、功能性質(zhì)和消化性質(zhì)[13]，過(guò)氧自由基氧化可影響核桃蛋白的結(jié)構(gòu)[14]。美藤果經(jīng)榨油后餅中殘余的脂質(zhì)極易被氧化，產(chǎn)生的自由基可能會(huì)影響美藤果蛋白的功能性質(zhì)。國(guó)內(nèi)外對(duì)美藤果蛋白氧化的研究趨于空白，研究羥自由基和過(guò)氧自由基對(duì)美藤果蛋白功能性質(zhì)的影響，可為調(diào)節(jié)改善美藤果蛋白產(chǎn)品的功能性質(zhì)及其加工利用提供思路。因此，本文采用氧化體系產(chǎn)生羥自由基和過(guò)氧自由基，對(duì)美藤果蛋白進(jìn)行不同程度的模擬氧化修飾，探究羥自由基和過(guò)氧自由基氧化對(duì)美藤果蛋白功能性質(zhì)的影響規(guī)律，為揭示美藤果蛋白氧化機(jī)制及其貯藏加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

美藤果餅，西雙版納印奇生物資源開發(fā)有限公司；一級(jí)大豆油，市售；牛血清蛋白，純度98%；30%雙氧水(H2O2)；氯化鐵(FeCl3)、抗壞血酸、2,2′-鹽酸脒基丙烷(AAPH)、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、5,5-二巰基-2,2-二硝基苯甲酸(DTNB)等，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

5804R高速冷凍離心機(jī)，F(xiàn)E28-Standard pH計(jì)，ModulyoD-230真空冷凍干燥機(jī)，HJ-5多功能攪拌器，UV-1000紫外可見分光光度計(jì)，F(xiàn)J200-SH高速分散均質(zhì)機(jī)，KjeltecTM8400凱氏定氮儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 美藤果蛋白的制備

美藤果餅粉碎后，按料液比1∶5加入石油醚，室溫?cái)嚢? h進(jìn)行脫脂，重復(fù)脫脂2次，風(fēng)干后過(guò)60目篩制成美藤果脫脂粉。脫脂粉與水按料液比 1∶30混勻，調(diào)pH至9.5，在70℃下提取2 h，經(jīng)4 500×g離心30 min，取上清液調(diào)pH至5，經(jīng)4 500×g離心30 min，將沉淀pH調(diào)至中性，凍干即為美藤果蛋白(經(jīng)測(cè)定其脂肪含量<0.1%)。

1.2.2 羥自由基和過(guò)氧自由基氧化美藤果蛋白的制備

參考文獻(xiàn)[15]建立羥自由基模擬氧化體系，制備氧化美藤果蛋白。配制美藤果蛋白溶液，使蛋白在體系中終質(zhì)量濃度為10 mg/mL，固定FeCl3和抗壞血酸在體系中終濃度為0.1 mmol/L，添加H2O2使其終濃度分別為0、0.1、0.5、1、5、10、15 mmol/L，于37℃下反應(yīng)1 h，然后添加EDTA終止氧化，透析、凍干備用。

參考文獻(xiàn)[16]建立過(guò)氧自由基模擬氧化體系，制備氧化美藤果蛋白。配制美藤果蛋白溶液，使蛋白在體系中終質(zhì)量濃度為10 mg/mL，添加AAPH使其終濃度分別為0、0.04、0.2、0.5、1、3、5、10 mmol/L，于37℃避光反應(yīng)24 h，然后冰浴降溫至4℃，透析、凍干備用。

1.2.3 美藤果蛋白羰基含量的測(cè)定

參照Huang等[17]方法略作改動(dòng)。配制10 mg/mL 的美藤果蛋白溶液，并測(cè)定溶液中的蛋白質(zhì)濃度。取1.5 mL美藤果蛋白溶液，加入1 mL 10 mmol/L DNPH溶液(含2 mol/L HCl)，室溫避光反應(yīng)1 h后，添加1 mL 20%的三氯乙酸混勻，經(jīng)8 000×g離心15 min，沉淀以1 mL乙酸乙酯-乙醇(體積比1∶1)洗滌3次后，添加4 mL 6 mol/L尿素于37℃下溶解20 min，經(jīng)8 000×g離心15 min，取上清液于370 nm處測(cè)定吸光值，以22 000 L/(mol·cm)消光系數(shù)計(jì)算美藤果蛋白的羰基含量。

1.2.4 美藤果蛋白總巰基與游離巰基含量的測(cè)定

參照Huang等[17]方法略作改動(dòng)。配制10 mg/mL 的美藤果蛋白溶液，并測(cè)定溶液中的蛋白質(zhì)濃度。取1 mL美藤果蛋白溶液添加至4 mL 0.1 mol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液(含1 mmol/L EDTA和1% SDS)中，加入0.05 mL 4 mg/mL DTNB溶液于25℃反應(yīng)1 h，經(jīng)8 000×g離心30 min，取上清液于412 nm處測(cè)定吸光值，以13 600 L/(mol·cm) 消光系數(shù)計(jì)算游離巰基含量?？値€基含量的測(cè)定：取1 mL美藤果蛋白溶液添加至4 mL 0.1 mol/L尿素-鹽酸胍混合溶液中，加入0.05 mLβ-巰基乙醇于25℃反應(yīng)1 h，加5 mL 12%的三氯乙酸，于8 000×g離心15 min，沉淀用5 mL 12%的三氯乙酸洗滌2次后，溶于0.1 mol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液(含1 mmol/L EDTA和1% SDS)，加入0.05 mL 4 mg/mL DTNB溶液后操作與游離巰基相同。

1.2.5 美藤果蛋白溶解性的測(cè)定

參照Peyrano等[18]方法略作改動(dòng)。配制1 mg/mL 美藤果蛋白溶液，室溫?cái)嚢? h，經(jīng) 5 500×g離心15 min，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)含量。采用凱氏定氮法測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)含量，按式(1)計(jì)算美藤果蛋白的溶解性。

溶解性=上清液蛋白質(zhì)含量/樣品中蛋白質(zhì)含量×100%

(1)

1.2.6 美藤果蛋白乳化性與乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

(2)

(3)

式中：A0為0 min的吸光值；A10為靜置10 min的吸光值；N為稀釋因子，500；c為蛋白質(zhì)量濃度，g/mL；φ為乳狀液油相體積分?jǐn)?shù)，25%；L為比色光徑，1 cm；t為時(shí)間間隔,10 min。

1.2.7 美藤果蛋白起泡性與泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

參照Cano-Medina等[20]方法略作改動(dòng)。配制30 mL 1 mg/mL美藤果蛋白溶液，經(jīng)15 000 r/min分散3 min后，分別記錄0 min和靜置30 min的體積，美藤果蛋白的起泡性與泡沫穩(wěn)定性分別按式(4)、式(5)計(jì)算。

(4)

(5)

式中：V為初始體積，mL；V0為分散后0 min的體積，mL；V30為靜置30 min的體積，mL。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)均平行測(cè)定3次，采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，采用SPSS 25進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，采用Origin 2018進(jìn)行繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化對(duì)美藤果蛋白羰基含量的影響

羰基化是蛋白質(zhì)氧化損傷后最明顯的表征之一[10]，因而羰基含量可衡量美藤果蛋白氧化程度。美藤果蛋白在羥自由基和過(guò)氧自由基氧化體系中羰基含量的變化如圖1所示。

注：A.羥自由基氧化體系；B.過(guò)氧自由基氧化體系；圖中不同字母表示同組間不同氧化程度的美藤果蛋白樣品之間差異顯著(P<0.05)。下同。

由圖1可見，經(jīng)羥自由基和過(guò)氧自由基氧化修飾后，美藤果蛋白的羰基含量均明顯增加。美藤果蛋白的羰基對(duì)H2O2濃度的變化敏感，當(dāng)H2O2濃度達(dá)15 mmol/L時(shí)，羰基含量最高，相比0 mmol/L時(shí)增加了2.10倍(P<0.05)；低濃度AAPH(0～0.2 mmol/L)對(duì)美藤果蛋白羰基含量的影響不顯著(P>0.05)，而當(dāng)AAPH濃度達(dá)10 mmol/L時(shí)，羰基含量最高，相比0 mmol/L時(shí)增加了2.28倍(P<0.05)?？梢姳疚乃⒌难趸w系誘導(dǎo)美藤果蛋白發(fā)生了不同程度的氧化修飾。Wu[16]、盧巖[12]等均發(fā)現(xiàn)，隨著自由基濃度的加大，蛋白質(zhì)的羰基含量會(huì)顯著增加(P<0.05)。H2O2和AAPH濃度越高，產(chǎn)生的自由基濃度越高，美藤果蛋白受自由基攻擊程度越劇烈，催化蛋白質(zhì)氧化損傷速度也隨之加快，從而導(dǎo)致羰基衍生物產(chǎn)生并逐漸積累，顯現(xiàn)出美藤果蛋白羰基化現(xiàn)象。

2.2 氧化對(duì)美藤果蛋白總巰基與游離巰基含量的影響

蛋白質(zhì)的巰基和二硫鍵是穩(wěn)定其分子構(gòu)象的重要化學(xué)鍵，因而巰基的變化可視為蛋白質(zhì)氧化最初的反應(yīng)之一[21]。美藤果蛋白在羥自由基和過(guò)氧自由基氧化體系中巰基含量的變化如圖2所示。

圖2 氧化對(duì)美藤果蛋白巰基含量的影響

由圖2可見，美藤果蛋白經(jīng)兩種自由基氧化修飾后，總巰基和游離巰基含量總體呈下降趨勢(shì)。低濃度H2O2(0～1 mmol/L)對(duì)美藤果蛋白游離巰基的影響不顯著(P>0.05)，H2O2濃度達(dá)10 mmol/L時(shí)，總巰基和游離巰基含量不再顯著降低，達(dá)最高濃度時(shí)降幅分別為25.75%和85.97%(P<0.05)；低濃度AAPH(0～0.2 mmol/L)對(duì)美藤果蛋白游離巰基的影響不顯著(P>0.05)，當(dāng)AAPH濃度達(dá)5 mmol/L時(shí)，總巰基和游離巰基含量不再顯著降低，達(dá)最高濃度時(shí)降幅分別為31.79%和83.33%(P<0.05)?？梢娏u自由基和過(guò)氧自由基均使美藤果蛋白的總巰基與游離巰基含量降低。劉娟[22]和尤翔宇[13]也發(fā)現(xiàn)自由基氧化可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的總巰基與游離巰基含量降低。自由基氧化可影響巰基和二硫鍵交互反應(yīng)平衡常數(shù)的改變[23]，游離巰基下降意味著美藤果蛋白疏水基團(tuán)中的巰基轉(zhuǎn)化形成了二硫鍵。巰基逐漸氧化可形成非二硫鍵的含硫化合物[24]，總巰基含量降低說(shuō)明羥自由基和過(guò)氧自由基也可氧化導(dǎo)致美藤果蛋白二硫鍵斷裂，發(fā)生不可逆氧化反應(yīng)，氧化程度隨之增大。

2.3 氧化對(duì)美藤果蛋白溶解性的影響

美藤果蛋白在羥自由基和過(guò)氧自由基氧化體系中溶解性的變化如圖3所示。

圖3 氧化對(duì)美藤果蛋白溶解性的影響

由圖3可見，經(jīng)兩種自由基氧化修飾后，美藤果蛋白溶解性總體呈下降趨勢(shì)。低濃度H2O2(0～0.5 mmol/L)對(duì)美藤果蛋白溶解性的影響不顯著(P>0.05)，當(dāng)H2O2濃度達(dá)15 mmol/L時(shí)，溶解性最低，相比0 mmol/L時(shí)降低46.92%(P<0.05)；低濃度AAPH(0～0.2 mmol/L)對(duì)美藤果蛋白溶解性的影響不顯著(P>0.05)，當(dāng)AAPH濃度達(dá)5 mmol/L時(shí)，美藤果蛋白溶解性不再顯著降低，達(dá)最高濃度時(shí)降幅為30.51%(P<0.05)?？梢姷蜐舛茸杂苫鶎?duì)美藤果蛋白溶解性的影響不大，但隨著自由基濃度的增加美藤果蛋白溶解性降低，主要是由于二硫鍵的生成易使美藤果蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，聚集生成不溶性聚集體及交聯(lián)物，對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。另外，美藤果蛋白結(jié)構(gòu)的展開，會(huì)使一些分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露出來(lái)，而親水基團(tuán)在表面的分布相對(duì)較少，很可能也是美藤果蛋白溶解性降低的原因之一。周麟依[24]、葉林等[25]均發(fā)現(xiàn)，經(jīng)氧化的植物蛋白會(huì)產(chǎn)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致不溶性交聯(lián)聚集體的形成，從而降低蛋白質(zhì)的溶解性。

2.4 氧化對(duì)美藤果蛋白乳化性與乳化穩(wěn)定性的影響

美藤果蛋白在羥自由基和過(guò)氧自由基氧化體系中乳化性能的變化如圖4所示。

圖4 氧化對(duì)美藤果蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

由圖4可見，經(jīng)兩種自由基氧化修飾后，美藤果蛋白的乳化性能總體呈先上升后下降趨勢(shì)。美藤果蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性在H2O2濃度為1 mmol/L 時(shí)達(dá)最大值，分別為76.37 m2/g和23.12 min；在AAPH濃度為1 mmol/L時(shí)美藤果蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性也達(dá)最大值，分別為101.12 m2/g和20.77 min?？梢娺m度的氧化可提高美藤果蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性。崔旭海[26]發(fā)現(xiàn)，低濃度自由基氧化對(duì)提高乳清蛋白的乳化性能有利，但在高濃度條件下具有破壞作用。孫領(lǐng)鴿等[23]認(rèn)為乳化性能與蛋白質(zhì)的交聯(lián)及結(jié)構(gòu)完整性有關(guān)。植物蛋白的乳化性能與二硫鍵含量有間接關(guān)聯(lián)[27]，自由基氧化巰基所形成的二硫鍵可使蛋白質(zhì)產(chǎn)生交聯(lián)[11]。本研究中，低濃度氧化條件下，美藤果蛋白因巰基氧化形成的二硫鍵而交聯(lián)，產(chǎn)生較大的表面積可使其蛋白質(zhì)與油滴更好地結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致乳化性與乳化穩(wěn)定性的增加；高濃度氧化條件下，美藤果蛋白的交聯(lián)聚合物會(huì)解體或重新生成，使變性劇烈的美藤果蛋白穩(wěn)定性變差，乳化過(guò)程中結(jié)合油滴的能力大部分喪失，最終導(dǎo)致乳化性與乳化穩(wěn)定性降低。

2.5 氧化對(duì)美藤果蛋白起泡性與泡沫穩(wěn)定性的影響

美藤果蛋白在羥自由基和過(guò)氧自由基氧化體系中起泡性能的變化如圖5所示。

圖5 氧化對(duì)美藤果蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響

由圖5可見，經(jīng)兩種自由基氧化修飾后，美藤果蛋白的起泡性與泡沫穩(wěn)定性總體呈先上升后下降趨勢(shì)。美藤果蛋白的起泡性與泡沫穩(wěn)定性在H2O2濃度為5 mmol/L時(shí)達(dá)最大值，分別為22.89%和59.56%；在AAPH濃度為3 mmol/L時(shí)，美藤果蛋白的起泡性與泡沫穩(wěn)定性達(dá)最大值，分別為23.90%和69.72%?？梢娺m度的氧化可提高美藤果蛋白的起泡性與泡沫穩(wěn)定性。Wang等[28]發(fā)現(xiàn)，自由基氧化可使蛋清蛋白起泡性與泡沫穩(wěn)定性先升高后降低，且當(dāng)H2O2濃度大于5 mmol/L時(shí)起泡性能逐漸下降。Duan等[29]發(fā)現(xiàn)，適度AAPH氧化處理可提高蛋清蛋白起泡性能。隨著自由基濃度的增加，美藤果蛋白結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生不同的變化，低濃度氧化時(shí)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)部分展開，分子間相互作用與水結(jié)合形成較穩(wěn)定的吸附膜，進(jìn)而提高美藤果蛋白的起泡性與泡沫穩(wěn)定性，但自由基濃度過(guò)高會(huì)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，此時(shí)美藤果蛋白與水的作用減弱，形成泡沫能力隨之下降，最終導(dǎo)致起泡性與泡沫穩(wěn)定性降低。

3 結(jié) 論

美藤果蛋白經(jīng)羥自由基和過(guò)氧自由基體系氧化后，羰基含量均隨著自由基濃度的增大呈現(xiàn)顯著升高的趨勢(shì)；游離巰基、總巰基含量和溶解性均隨自由基濃度的增加而逐漸降低；乳化性與乳化穩(wěn)定性、起泡性與泡沫穩(wěn)定性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中乳化性與乳化穩(wěn)定性分別在H2O2和AAPH濃度均為1 mmol/L時(shí)最高，起泡性與泡沫穩(wěn)定性分別在H2O2濃度為5 mmol/L和AAPH濃度為3 mmol/L時(shí)最高。結(jié)果表明，美藤果蛋白對(duì)羥自由基和過(guò)氧自由基都較為敏感，自由基氧化可顯著改變其功能性質(zhì)，通過(guò)控制羥自由基和過(guò)氧自由基的氧化程度，可實(shí)現(xiàn)對(duì)美藤果蛋白功能性質(zhì)的調(diào)控。此外，低濃度自由基氧化在一定程度上提高了美藤果蛋白的乳化性和起泡性，可為食品加工生產(chǎn)中獲得具有優(yōu)良界面性質(zhì)的美藤果蛋白產(chǎn)品提供思路。在美藤果的加工與貯藏過(guò)程中應(yīng)適度控制氧化反應(yīng)的程度，避免美藤果蛋白產(chǎn)品品質(zhì)的劣變，以保證其食用安全性。