李紓?cè)?諶翰林

(湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物催化和酶工程國家重點實驗室 環(huán)境微生物技術(shù)中心，湖北 武漢 430062)

0 引言

地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)作為一種生物安全性菌株，其發(fā)酵產(chǎn)物(納豆激酶、淀粉酶、聚-γ-谷氨酸、桿菌肽等)常應(yīng)用于食品類、化妝品類等生物制品的生產(chǎn)中[1]。B. licheniformis屬于典型的好氧菌，在其發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，包括超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥基自由基(·OH)，而ROS的存在會對細(xì)胞造成巨大損傷，使得DNA斷裂、蛋白羰基化、脂質(zhì)過氧化，最終造成細(xì)胞衰老和死亡[1]。

菌體的氧化應(yīng)激反應(yīng)受到ROS誘導(dǎo)和生長時期的影響。芽胞桿菌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PerR和OhrR均會受到ROS的攻擊而使得結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而調(diào)控多種抗氧化劑的合成以抵抗ROS的氧化傷害[2]。同時，ROS通常在對數(shù)中后期大量積累，在穩(wěn)定期合成最大，不同時期的細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的能力也不相同，一般穩(wěn)定期細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力強于早期細(xì)胞[3]。

1 細(xì)菌的氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激指當(dāng)細(xì)胞受到對自身有害刺激時，產(chǎn)生過多的高活性分子如活性氧自由基(ROS)與活性氮自由基(RNS)，氧化物的生成速率大于氧化物的清除速率，導(dǎo)致氧化和抗氧化這兩個系統(tǒng)處于失衡狀態(tài)而造成損傷。真核生物在這一現(xiàn)象的研究比較多，真核細(xì)胞可以在氧化應(yīng)激時通過調(diào)節(jié)tRNA來調(diào)控自身狀態(tài)[3]。目前對細(xì)菌等原核生物的氧化應(yīng)激調(diào)控機制研究相對較少。實驗中發(fā)現(xiàn)，大部分的細(xì)菌受到氧化刺激之后，會通過基因調(diào)節(jié)的機制來緩解損傷[4-5]。

1.1 活性氧自由基與活性氮自由基

研究發(fā)現(xiàn)，ROS包括有超氧陰離子(O2-)、羥自由基(·OH)與過氧化氫(H2O2)等；RNS則是一氧化氮(NO)、二氧化氮(NO2)和過氧化硝酸鹽(ONOO-)。而細(xì)菌中主要涉及ROS。

ROS中，O2-和H2O2是由呼吸脫氫酶的自氧化作用形成的。在正常周轉(zhuǎn)期間，這些酶使用黃素輔因子從有機底物中接受氫化物陰離子。然后，還原的黃素一次次將電子轉(zhuǎn)移到酶中的次級氧化還原部分上，該次級氧化還原部分是鐵硫簇或結(jié)合的醌。但是，如果氧氣在將電子傳遞到下一個載流子之前與還原的黃素發(fā)生碰撞，則電子會從FADH2跳到氧氣上而生[1]。

分子氧本身在π反鍵軌道上有兩個自旋排列的未配對電子(圖1)。這種結(jié)構(gòu)使得具有自旋對電子的有機分子不能一次將多個電子轉(zhuǎn)移到氧。因為氧是一種相對較弱的單價電子受體，這種限制確保了氧不能有效地氧化氨基酸和核酸。然而，氧的未成對電子很容易與過渡金屬和有機自由基的未成對電子相互作用。

相比而言，氧自由基、過氧化氫和羥基自由基的還原電位決定了它們在熱力學(xué)上是比雙氧強得多的單價氧化劑(圖2)。O2-的陰離子電荷抑制了其作為富電子分子氧化劑的有效性，而H2O2的活性則因其氧-氧鍵的穩(wěn)定性而降低。但這兩個特征都不適用于羥基自由基，·OH與大多數(shù)生物分子的反應(yīng)幾乎是擴散受限的。

圖1 分子氧、超氧化物、過氧化氫和單線態(tài)氧的分子軌道圖

圖2 活性氧還原電位(1M雙氧水為標(biāo)準(zhǔn)態(tài))

1.2 氧化應(yīng)激危害

細(xì)胞中氧化應(yīng)激的危害主要存在于三方面：脂類的氧化、DNA的氧化和蛋白質(zhì)的損傷。

活性自由基直接進攻細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，而導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)、性質(zhì)的改變以及蛋白質(zhì)紊亂，產(chǎn)生的醛類則會進一步損傷細(xì)胞。

活性基團進攻核苷酸中堿基和糖的部位，導(dǎo)致DNA骨架的斷裂；還能引入外來的堿基、糖基，并與其他分子鏈接來阻止DNA的復(fù)制。活性基團還會攻擊蛋白質(zhì)，氧化其氨基酸側(cè)鏈殘基變成硫醇基和羰基，從而導(dǎo)致了蛋白質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)的改變。

2 細(xì)菌氧化應(yīng)激的防御機制

氧化應(yīng)激的防御機制主要分為兩級：一級防御，酶抗氧化系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)，來使活性基團保持在合理水平；二級防御，用來修復(fù)氧化的損傷，如DNA修復(fù)、蛋白水解酶等。

最新研究表明大多數(shù)細(xì)菌中主要是SoxRS、OxyR這兩個氧化還原應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子來應(yīng)對氧化應(yīng)激[6]。

2.1 SoxRS調(diào)控機制

SoxRS的調(diào)控子是由兩個編碼獨立轉(zhuǎn)錄激活子的基因SoxR、SoxS組成，能表達(dá)出SoxR、SoxS兩種蛋白。

其中SoxR蛋白是MerR蛋白家族的成員之一，分子量有17 kD。其N端是一個特殊結(jié)構(gòu)能與DNA特異性結(jié)合；其C端是4個半胱氨酸殘基的序列，可以結(jié)合金屬配體。

在溶液中以二聚體形式存在，單體中都含有[2Fe-2S]中心，是一個能感知氧化脅迫的分子開關(guān)。激活的SoxR能與SoxS啟動子牢牢結(jié)合，具有高度親和性。關(guān)于結(jié)合方式，在對SoxS啟動子區(qū)的缺失實驗結(jié)果表明，SoxS啟動子-10區(qū)到-35區(qū)之間的間隔區(qū)對SoxR的結(jié)合與轉(zhuǎn)錄的激活起重要作用。推測可能是正常還原性SoxR結(jié)合在SoxS啟動子上，RNA聚合酶結(jié)合在SoxR-DNA復(fù)合體上，此時為閉合結(jié)構(gòu)，無轉(zhuǎn)錄激活活性。當(dāng)氧化脅迫時，[2Fe-2S]中心被氧化，復(fù)合體開放，轉(zhuǎn)錄激活。

SoxRS調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)控順序如下：SoxR由超氧化物刺激后的激活SoxS基因表達(dá)；SoxS蛋白含量增多而激活各個被調(diào)控基因表達(dá)，從而使細(xì)胞產(chǎn)生抗氧化。其中被調(diào)控基因包括：SodA、AcrAB、fpr等?？梢宰饔糜冢貉趸锴宄?超氧化物歧化酶)、膜透性調(diào)節(jié)及外排、DNA修復(fù)(核酸內(nèi)切酶)[6]。

2.2 脯氨酸代謝增強katG表達(dá)和氧化應(yīng)激抗性

Lu Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn)研究表明，除了提供能量外，脯氨酸代謝還影響不同生物體的抗氧化應(yīng)激能力。通過構(gòu)建大腸桿菌野生型和putA突變株的應(yīng)激實驗發(fā)現(xiàn)putA突變株對氧化應(yīng)激的敏感性明顯高于親本野生型菌株。用脯氨酸處理野生型細(xì)胞可顯著提高過氧化氫酶I(由katG編碼)的表達(dá)量和活性。同時katG菌株對脯氨酸沒有反應(yīng)，說明過氧化氫酶I在脯氨酸保護機制中起關(guān)鍵作用。脯氨酸氧化代謝可產(chǎn)生過氧化氫，這表明脯氨酸通過預(yù)適應(yīng)效應(yīng)提高大腸桿菌的氧化應(yīng)激耐受性，包括內(nèi)源性過氧化氫生成和過氧化氫酶過氧化物酶活性的增強。

2.3 OxyR調(diào)控機制

OxyR屬于LysR蛋白家族，分子量是34kD。在100～1000μMH2O2的脅迫下，會在分子內(nèi)形成二硫鍵，由還原態(tài)轉(zhuǎn)為氧化態(tài)，從而結(jié)合啟動子來調(diào)控基因。其調(diào)控基因有：katG(過氧化酶)、dps(DNA結(jié)合蛋白)等來清除細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫、保護DNA[6]。

MAYUREE FUANGTHONG,SOPAPAN ATICHARTPONGKUL[11]d等通過對枯草芽孢桿菌中OhrA和OhrB的突變分析發(fā)現(xiàn)OhrA和OhrB共同參與了枯草芽孢桿菌的抗氧化應(yīng)激過程，其中OhrA蛋白在細(xì)胞生長中起著更重要的作用，且其表達(dá)受到OhrR的抑制。

3 結(jié)語

目前對多種調(diào)控因子調(diào)控地衣芽胞桿菌的抗氧化機制還不清楚，如何清除超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)與羥自由基(·OH)等活性自由基也還處于研究階段。將來隨著對其研究的深入會進一步闡明各類調(diào)控因子對抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶的調(diào)控機制，以及對半胱氨酸代謝、H2S代謝、Fe代謝等代謝途徑的調(diào)節(jié)。還可以通過代謝組、轉(zhuǎn)錄組的研究，挖掘多種全局調(diào)控基因的作用，通過加深對地衣芽胞桿菌完整生理過程的認(rèn)識，可以為以后的工業(yè)菌株改造提供依據(jù)。