董煥成，買文寧,呂志栓

（1.喀什大學(xué)土木工程學(xué)院，喀什844000；2.鄭州大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院,河南鄭州450001）

苯胺能夠和血紅蛋白相結(jié)合生成高鐵紅蛋白，從而可使血紅蛋白和氧的結(jié)合力降低，導(dǎo)致動物出現(xiàn)中毒的現(xiàn)象，對生物體造成嚴(yán)重程度上的危害[1]。苯胺是一種嚴(yán)重污染環(huán)境以及危害人體生命健康的有害物質(zhì)，有一定的致癌性[2]。印染，塑料，農(nóng)藥，醫(yī)藥等工業(yè)生產(chǎn)的廢水都含有較高濃度的苯胺[3]。苯胺類染化廢水一般呈黃棕色，如果不經(jīng)處理直接排入水體中，會對水體環(huán)境造成污染，進(jìn)而危害到人類的健康。

高通量測序技術(shù)，也稱深度測序、“下一代”測序技術(shù)，一次能夠?qū)资f條乃至上百萬的DNA分子來進(jìn)行測定，并且其一般讀長比較短，另外能夠?qū)σ粋€(gè)物種的基因組及轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行細(xì)致地全貌分析[4,5]。而且高通量測序直接對微生物進(jìn)行測定，不需要進(jìn)行培養(yǎng)，能夠更加客觀地反映微生物菌群的多樣性[6]。本試驗(yàn)通過用高通量測序法對反應(yīng)進(jìn)程中活性污泥微生物菌群多樣性的變化進(jìn)行研究，探討苯胺類染化廢水對活性污泥中微生物群落的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用水取自新鄉(xiāng)某染化公司，其COD 為30000mg/L，BOD5為12000mg/L，NH3-N 為12.16mg/L，SO42-為70480mg/L，SS 為600mg/L，pH 為11.03，含鹽量為17%。實(shí)驗(yàn)所接種的好氧污泥TS 為5.81 g/L，VS/TS 為54.47%。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

試驗(yàn)所用總體積為9L 的反應(yīng)器，其有效容積6 L。進(jìn)水采用瞬時(shí)進(jìn)水法、排水采用虹吸排水法。反應(yīng)過程中通過內(nèi)置曝氣頭進(jìn)行曝氣。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在反應(yīng)器內(nèi)通入4L 實(shí)驗(yàn)用水、2L 好氧污泥，使其充分混合接觸，溫度為室溫，pH 值控制在7.5左右，每天定時(shí)取樣測定其COD 值，當(dāng)隨著每次進(jìn)水后COD 值達(dá)到不變時(shí)，可看作一個(gè)運(yùn)行周期。試驗(yàn)所用的污泥樣品分別于第0、3、6 周期取樣，并分別編號1 號、2 號、3 號。對3 個(gè)樣品委托上海生工生物有限公司進(jìn)行高通量測序，對微生物菌群多樣性的變化進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 OTU 分析

對3 個(gè)污泥樣品進(jìn)行高通量測序，測序結(jié)果如表1 顯示序列長度大部分分布在400～600bp 之間，平均長度為440bp，可以看出測序結(jié)果比較好。為提高后續(xù)的質(zhì)量分析和數(shù)據(jù)可靠性，對原始序列進(jìn)行去接頭、質(zhì)量剪切等處理[7]。在過濾低質(zhì)量以及短長度序列之后，反應(yīng)初期污泥樣品中有36461 個(gè)序列，其平均長度415。中期有36907 個(gè)序列，其平均長度410。后期有47661 個(gè)序列，其平均長度408。后經(jīng)去嵌合體及靶外序列，初期有31874 個(gè)序列，中期有25031 個(gè)序列，后期有26253個(gè)序列。共獲83158 條，并聚類于12356 個(gè)OTU。

表1 3 個(gè)污泥樣品的高通量測序數(shù)據(jù)

通過圖1 統(tǒng)計(jì)三個(gè)樣品中共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，直觀展現(xiàn)出活性污泥中微生物多樣性和豐度，由圖1 可以看出，反應(yīng)三個(gè)階段的OTU 數(shù)目分別為8303、2115 和1938 個(gè)，其中三個(gè)污泥樣品的共有OTU 數(shù)為112，特有OTU 數(shù)分別為7888、1325 和1305。反應(yīng)初期和中期污泥樣品的共有OTU 數(shù)為342，反應(yīng)初期和后期污泥樣品的共有OTU 數(shù)為185，反應(yīng)中期和后期污泥樣品的共有OTU 數(shù)為560。

圖1 VENN 圖

2.2 α-多樣性分析

三個(gè)樣品的微生物菌群通過α-多樣性分析的各項(xiàng)指標(biāo)如表2 所示。由表2 可得，在97%的分類水平上，覆蓋率值均>83%，能夠真實(shí)地反映污泥樣品中微生物群落的信息。反應(yīng)初期的Shannon 指數(shù)7.50 比中期4.76 和后期4.96 大，Chao1 指數(shù)19705 比中期5517 和后期4348 大，ACE 指數(shù)32516 比中期8029 和后期6551 大，而Simpson 指數(shù)0.0042 比中期0.0421 和后期0.0324小，因此反應(yīng)初期的微生物菌群多樣性與中后期不同，其復(fù)雜程度隨著反應(yīng)進(jìn)程明顯降低，也說明微生物菌群多樣性在逐漸減少。

2.3 Beta 多樣性分析

Beta 多樣性分析結(jié)果顯示樣品之間微生物菌群的相似度[8]。對三組樣品進(jìn)行樣本聚類分析，結(jié)果顯示反應(yīng)中、后期污泥中微生物菌群組成的相似度可達(dá)88.75%，與反應(yīng)初期相比差異較大。由圖2 和圖3 中同樣可得，反應(yīng)中、后期在圖中較為聚集，表明其相似度較高。而反應(yīng)前期距離中、后期均較遠(yuǎn)，表明其相似度較低。

表2 3 組污泥樣品的α-多樣性指數(shù)

圖2 樣本聚類圖

圖3 PCoA 分析（2dplot）

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以苯胺類染化廢水為研究對象，通過高通量測序法對微生物菌群的多樣性進(jìn)行OTU分析、Alpha 多樣性分析、Beta 多樣性分析。結(jié)果表明，通過利用苯胺類染化廢水對活性污泥進(jìn)行馴化，微生物菌群多樣性在不斷減少，隨著反應(yīng)周期的增加，微生物組成的差異性不斷降低，污泥中細(xì)菌群落變化較為顯著，即可能會促進(jìn)某些微生物菌群的增長繁殖，同時(shí)也可能抑制部分細(xì)菌生長。