王 瓊，周 利，鄒 燃，樂 薇，楊 敏，孫 濱，龐爭爭，徐派的

(1.武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院針灸科，湖北 武漢 430000；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，湖北 武漢 430000)

高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。高血脂水平導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，通過一系列炎癥、免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，造成內(nèi)皮下脂質(zhì)堆積[2]。大量研究[3-5]證實(shí)，巨噬細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)在維持膽固醇動(dòng)態(tài)平衡，防止血管炎癥病變中發(fā)揮重要作用，是目前治療動(dòng)脈粥樣硬化的重要靶點(diǎn)。前期臨床研究已發(fā)現(xiàn)，針刺豐隆穴可提高高脂血癥大鼠ABCA1的表達(dá)，促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，并減輕巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[6-8]。有臨床研究[9-10]表明，針刺豐隆穴可顯著降低高脂血癥患者血脂水平。但關(guān)于針刺豐隆穴對(duì)降低高脂血癥患者血脂長期療效及巨噬細(xì)胞ABCA1信號(hào)調(diào)節(jié)作用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定治療前后及治療后3個(gè)月、6個(gè)月高脂血癥患者血脂水平變化，并檢測(cè)巨噬細(xì)胞中ABCA1 mRNA及蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步探究電針豐隆穴對(duì)高脂血癥患者的臨床療效及對(duì)巨噬細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照1997年中華心血管病雜志編輯委員會(huì)《血脂異常防治建議》標(biāo)準(zhǔn)[11]。正常飲食狀態(tài)下，禁食12～14 h后，監(jiān)測(cè)血脂水平。達(dá)到以下三項(xiàng)中的一項(xiàng)或以上者可診斷為高脂血癥：①總膽固醇(total cholesterol，TC)≥5.20 mmol/L；②低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)≥3.12 mmol/L；③三酰甘油(triacylglycerol，TG)≥1.70 mmol/L。

1.1.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2002年國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中關(guān)于高脂血癥(痰濁阻遏證)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]制定。主癥：體胖，胸悶脘痞，喜嘔吐痰涎，頭重如裹，肢體沉重麻木；兼癥：失眠，口淡，納差，食少等；舌脈：舌淡胖，苔白膩，脈弦滑。以上主癥具備兩項(xiàng)，結(jié)合兼癥、舌象、脈象即可診斷。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合中醫(yī)痰濁阻遏證和西醫(yī)高脂血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡在30歲至70歲之間，診斷為原發(fā)性高脂血癥患者；③或曾服用調(diào)脂藥物治療，但已停藥兩周以上，血脂水平仍符合診斷標(biāo)準(zhǔn)者；④對(duì)試驗(yàn)知情并簽署知情同意書者。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①對(duì)降血脂藥物過敏者，妊娠期或哺乳期婦女；②半年內(nèi)曾患心腦血管意外，如急性心肌梗死、腦梗死，嚴(yán)重創(chuàng)傷或重大手術(shù)后患者；③年齡<30歲或>70歲，診斷為繼發(fā)性高脂血癥患者；④純合子型高膽固醇血癥患者，及由服用藥物(如吩噻嗪類、部分避孕藥、腎上腺皮質(zhì)類固醇)引起的高脂血癥；⑤正在使用肝素、甲狀腺素治療藥物及其他影響血脂代謝藥物的患者；⑥近兩周內(nèi)接受其他降脂療法的患者；⑦合并肺、肝、腎等其他系統(tǒng)嚴(yán)重原發(fā)性疾??；⑧精神病患者。

1.4 剔除標(biāo)準(zhǔn) ①已進(jìn)入試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不符合納入標(biāo)準(zhǔn)或符合排除標(biāo)準(zhǔn)者；②在試驗(yàn)過程中，存在明顯的干預(yù)因素影響試驗(yàn)療效或安全性者；③試驗(yàn)期間出現(xiàn)病情惡化或死亡的患者；④試驗(yàn)過程中不愿繼續(xù)試驗(yàn)的患者；⑤出現(xiàn)嚴(yán)重不良事件或不良反應(yīng)的受試者。

1.5 一般資料 選取120例自2017年6月至2019年1月就診于武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院針灸科，符合納入標(biāo)準(zhǔn)的痰濁阻遏證高脂血癥患者，按隨機(jī)數(shù)字表分為電針組、藥物組、對(duì)照組。3組患者性別、年齡、病程等一般情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。本研究經(jīng)武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 3組痰濁阻遏證高脂血癥患者一般資料比較

2 方法

2.1 治療方法

2.1.1 電針組 患者取仰臥位，充分暴露雙下肢，選取雙側(cè)豐隆穴，局部常規(guī)無菌操作，將0.32 mm×50 mm“健衛(wèi)仕牌”無菌針灸針(中美合作泰成科技發(fā)展有限公司，型號(hào)S3210)以90°垂直皮膚快速進(jìn)針，進(jìn)針深度約40 mm。并取雙側(cè)豐隆穴近心端約0.5 cm處垂直刺一輔助針，深度約15 mm。雙側(cè)均接LH202H型韓氏穴位神經(jīng)儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司)，豐隆穴處接負(fù)極，輔助針處接正極。電針儀刺激參數(shù)：直流電，等幅疏密波，強(qiáng)度為8～12 mA，以患者耐受為度。每次留針30 min，每日治療1次，每周連續(xù)治療6 d，共治療8周。

2.1.2 藥物組 囑患者口服血脂康膠囊(北京北大維信生物科技有限公司，批號(hào) 20171158)，每日2次，每次2粒，共連服8周。

2.1.3 對(duì)照組 不予以特殊處理。

2.1.4 生活調(diào)攝 3組患者均囑其低脂飲食，改善生活方式(適當(dāng)增加運(yùn)動(dòng))，控制其他心血管病危險(xiǎn)因素，如限酒、戒煙、限鹽，并囑在治療期間禁用其他影響試驗(yàn)結(jié)果藥物及措施。

2.2 觀察指標(biāo)及方法

2.2.1 血脂檢測(cè) 分別于開始治療前1 d、治療結(jié)束后第2天、治療后3個(gè)月、治療后6個(gè)月，清晨空腹(可少量飲水)12 h，抽取前臂靜脈血。取血前1 d內(nèi)不飲酒，不做劇烈運(yùn)動(dòng)；若服用影響血脂水平藥物，應(yīng)記錄用藥情況。采用中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)推薦的方法檢測(cè)血清TC、TG、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)：TC及TG均采用酶比色法，HDL-C采用磷鎢酸鎂沉淀法，LDL-C采用聚乙烯硫酸沉淀法。

2.2.2 血清巨噬細(xì)胞內(nèi)ABCA1指標(biāo)檢測(cè) 將人血清與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。各組患者于治療結(jié)束后抽取靜脈血，留置于肝素鈉試管混勻。2 000 r/min離心10 min，取5 mL上層血清于EP管中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。將解融后的?xì)胞懸液離心，后置于完全培養(yǎng)基重懸，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，吸除原有培養(yǎng)基，用PBS洗一遍后加適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌?，消?～5 min，吹打細(xì)胞使細(xì)胞懸浮。選擇對(duì)數(shù)生長階段的細(xì)胞完成巨噬細(xì)胞培養(yǎng)。將單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞裝入1 mL 1640培養(yǎng)基(無胎牛血清)12孔板，隨機(jī)分為電針組、藥物組、對(duì)照組，分別加入不同患者血清250 μL共培養(yǎng)24 h。

采用RT-PCR法檢測(cè)各組人THP-1源巨噬細(xì)胞中ABCA1 mRNA含量。使用Trizol RNA試劑盒提取巨噬細(xì)胞總RNA。采用分光光度法測(cè)定RNA濃度后，按照逆轉(zhuǎn)錄說明書，用PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄RNA。以GAPDH為內(nèi)參，實(shí)時(shí)PCR定量分析各組細(xì)胞中ABCA1 mRNA含量。每個(gè)待測(cè)樣本均有3管平行管。采用2-ΔΔCT法，計(jì)算相對(duì)mRNA 的表達(dá)水平。引物序列見表2。

表2 引物序列

采用免疫印跡法檢測(cè)各組人THP-1源巨噬細(xì)胞中ABCA1的蛋白含量。提取各組巨噬細(xì)胞蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，于室溫下脫色搖床上用5%的脫脂牛奶(0.5% TBST配制)，封閉1 h。加入一抗ABCA1，1∶40 000稀釋，4 ℃孵育過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，1∶3 000稀釋，室溫下孵育30 min后，洗膜。免疫反應(yīng)后取出膜進(jìn)行ECL發(fā)光，顯影，定影。Photoshop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

2.3 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[13]制定。顯效：治療后血脂水平變化達(dá)到以下任何一項(xiàng)者，TC下降>20%，TG下降>40%，HDL-C上升>0.26 mmol/L，LDL-C下降>20%；有效：治療后血脂水平變化達(dá)到以下任何一項(xiàng)者，TC下降>10%且≤20%，TG下降>10%且≤40%，HDL-C上升>0.104 mmol/L且≤0.26 mmol/L，LDL-C下降10%且≤20%；無效：治療后血脂水平變化達(dá)到以下任何一項(xiàng)者，TC下降<10%，TG下降<10%，HDL-C上升<0.104 mmol/L，LDL-C下降<10%；惡化：治療后血脂水平變化達(dá)到以下任何一項(xiàng)者，TC上升>10%，TG上升>10%，HDL-C下降>0.104 mmol/L?？傆行?(顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。

3 結(jié)果

3.1 3組臨床療效比較 藥物組和電針組總有效率均高于對(duì)照組(P<0.05)。藥物組和電針組總有效率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明電針治療與藥物療效相當(dāng)。見表3。

表3 3組患者臨床療效比較

3.2 3組患者治療前后血脂水平比較 治療前3組TC、TG、HDL-C、LDL-C水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性；藥物組和電針組治療后TG、TC、LDL-C水平降低程度顯著大于對(duì)照組(P<0.05)，兩組治療前后TG、TC、LDL-C水平差值均較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)，兩組TG、TC、LDL-C水平差值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 3組患者治療前后血脂水平比較

3.3 隨訪期間3組患者血脂水平比較 電針組治療后3個(gè)月、6個(gè)月TC、TG、LDL-C水平與治療后比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，藥物組治療后3個(gè)月、6個(gè)月TC、TG、LDL-C水平均較治療后顯著上升(P<0.05)；兩組治療后、治療后3個(gè)月、6個(gè)月TC、TG、LDL-C水平仍顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見表5。

表5 隨訪期間3組患者血脂水平比較

3.4 3組患者巨噬細(xì)胞ABCA1 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 藥物組、電針組ABCA1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；兩組間ABCA1 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、圖2。

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05

4 討論

高脂血癥屬現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病名，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中，便有“脂者”“脂濁”的記載，現(xiàn)多歸屬為“痰濁”“痰瘀”等范疇。現(xiàn)代研究[14-15]認(rèn)為，其病機(jī)為過食膏粱厚味，肝脾腎臟腑功能紊亂，致痰濁化生，絡(luò)脈瘀阻，其中與脾虛痰濁關(guān)系最為密切，病機(jī)總屬本虛標(biāo)實(shí)。目前臨床上多以藥物治療為主，如中成藥物血脂康，以發(fā)酵而成的紅曲為主要成分，能消食、活血、除濕，臨床研究證實(shí)其能夠降低TC、TG、LDL-C，升高HDL-C，目前已被列入血脂異常治療指南[16]。其他一些治療藥物，如他汀類，存在肝腎功能損害、胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)。針灸在治療高脂血癥方面具有確定的療效及潛在優(yōu)勢(shì)[17-18]。目前針灸治療首選豐隆穴，以電針操作為主[19-20]?！队颀埜琛酚性疲骸疤刀嘁讼蜇S隆尋?！必S隆為足陽明胃經(jīng)絡(luò)穴，一穴通二經(jīng)，具有運(yùn)脾和胃、化痰利濕之功，為治痰要穴。故本研究以電針豐隆穴為治療組，與口服血脂康膠囊及空白對(duì)照比較，探究針刺治療高脂血癥的有效性。

在高血脂水平下，單核細(xì)胞經(jīng)氧化低密度脂蛋白及各類趨化因子、生長因子介導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，吞噬脂質(zhì)沉積于內(nèi)皮下，同時(shí)發(fā)生一系列炎癥、免疫反應(yīng)，最終形成動(dòng)脈粥樣硬化。而巨噬細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA1通過介導(dǎo)胞內(nèi)膽固醇和磷脂對(duì)HDL中載脂蛋白A1的活性轉(zhuǎn)運(yùn)，清除胞內(nèi)脂質(zhì)，降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)負(fù)荷。同時(shí)有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，ABCA1在抗炎機(jī)制中發(fā)揮重要作用，且其抗炎活性僅次于脂質(zhì)調(diào)節(jié)能力[4，21]。

本研究結(jié)果顯示，電針豐隆穴能有效降低患者血脂，對(duì)TC、TG、LDL-C有明顯下調(diào)作用，且長期療效較穩(wěn)定，優(yōu)于藥物治療。電針豐隆穴能顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞ABCA1 mRNA及蛋白的表達(dá)，表明其降脂機(jī)制可能是通過調(diào)控ABCA1信號(hào)通路，提高膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)效率而實(shí)現(xiàn)的。既往研究與本研究均證實(shí)針刺豐隆穴相比于藥物降脂療效更穩(wěn)定，且無肝酶升高等不良反應(yīng)，可作為一種安全有效的調(diào)節(jié)血脂方法[10]。由于本實(shí)驗(yàn)受試者樣本數(shù)較少，結(jié)果可能存在一定偏移，且僅對(duì)ABCA1表達(dá)進(jìn)行了初步研究。今后需開展更多的大樣本臨床研究，進(jìn)一步探討其下游的信號(hào)通路機(jī)制。