張靜，顏麗華，許偉，徐志陽(yáng)，丁現(xiàn)超

鄭州頤和醫(yī)院血液內(nèi)科，鄭州 450018

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是成年人最常見的惡性淋巴瘤之一，分為生發(fā)中心型（germinal center B cell，GCB）與非生發(fā)中心型（non-germinal center B cell，non-GCB）[1]。DLBCL病理上以彌漫性分布的惡性大B淋巴細(xì)胞為特征，病情嚴(yán)重者可危及生命[2]。及時(shí)治療可改善患者的生活質(zhì)量并延長(zhǎng)生存期，但由于DLBCL為一組異質(zhì)性疾病，其臨床特征、組織學(xué)、免疫表型、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)在不同患者間存在差異，患者在治療過程中產(chǎn)生的反應(yīng)及預(yù)后也各有不同，因此，對(duì)DLBCL發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行研究成為熱點(diǎn)問題[3]。

Ki-67是一種核蛋白，與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄有關(guān)，可作為細(xì)胞增殖活躍度的敏感指標(biāo)[4]。原癌基因B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-6（B cell lymphoma/leukemia-6，Bcl-6）蛋白是一種凋亡抑制因子，其功能與Ki-67相似，受Bcl-6調(diào)控的靶基因主要與細(xì)胞活化、分化和增殖相關(guān)[5]。本研究探討Ki-67、Bcl-6在DLBCL中的表達(dá)及與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為臨床診斷和治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月至2017年10月在鄭州頤和醫(yī)院初治的DLBCL患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：均行淋巴結(jié)活檢，并常規(guī)行免疫組織化學(xué)染色確診為DLBCL；生存期＞6個(gè)月；臨床資料完整。排版標(biāo)準(zhǔn)：合并壞死性淋巴結(jié)炎、傳染性單核細(xì)胞增多癥、轉(zhuǎn)移性腫瘤及髓外白血病等疾；合并嚴(yán)重惡病質(zhì)、免疫系統(tǒng)等重要系統(tǒng)及器臟功能不全。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入71例DLBCL患者，其中男39例，女32例；年齡24～70歲，中位年齡52.5歲，≥60歲31例，＜60歲40例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期35例，Ⅲ+Ⅳ期36例；乳酸脫氫酶（lactic acid dehydrogenase，LDH）水平：正常37例，增高34例；原發(fā)部位：淋巴結(jié)內(nèi)45例，淋巴結(jié)外26例；國(guó)際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）0～1分41例，≥2分30例；Hans分型：GCB-DLBCL 43例，non-GCB-DLBCL 28例；近期療效：完全緩解（complete response，CR）+部分緩解（partial response，PR）41例，疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）+疾病進(jìn)展（progressive disease，PD）30例。取 71例 DLBCL患者的DLBCL組織及其相應(yīng)的癌旁正常組織。

1.2 免疫組化法檢測(cè)Ki-67、Bcl-6蛋白的表達(dá)情況

取DLBCL組織及其相應(yīng)的癌旁正常組織制作成蠟塊連續(xù)切片，厚4～5 μm，放入80℃烤箱中烤片30 min后經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精水化；切片經(jīng)檸檬酸緩沖液煮沸法修復(fù)抗原，冷卻后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗；然后用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；切片滴加鼠抗人但克隆抗體（一抗），4℃下孵育過夜；PBS緩沖洗切片后滴加通用型免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）多聚體，37℃孵育15 min；PBS沖洗后采用現(xiàn)配二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑染色，蘇木素輕度復(fù)染細(xì)胞核沖洗脫水干燥后，中性樹膠封片，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

以腫瘤細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)定位清晰的棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性，Bcl-6采用定性判斷，隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，根據(jù)著色強(qiáng)度和視野中陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分[6]，著色強(qiáng)度：無著色計(jì)0分；淺黃色染色計(jì)1分，棕黃色染色計(jì)2分，棕褐色染色計(jì)3分；陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分：＜25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，＞50%計(jì)3分。將著色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分相乘：0～1分為陰性（-），2～4分弱陽(yáng)性（+），5～8分為中等陽(yáng)性（++），9～12分強(qiáng)陽(yáng)性（+++），陰性和弱陽(yáng)性為低表達(dá)，中等陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性為高表達(dá)。Ki-67采用定量判定方法，將陽(yáng)性細(xì)胞所占比例≥50%作為高表達(dá)（≥75%為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)），＜50%作為低表達(dá)。所有病理結(jié)果均經(jīng)2名以上病理學(xué)專家復(fù)核。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，DLBCL患者預(yù)后的影響因素采用Logistic回歸模型分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ki-67、Bcl-6蛋白表達(dá)情況的比較

DLBCL組織中Ki-67、Bcl-6蛋白高表達(dá)率均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 DLBCL組織和癌旁正常組織中Ki-67、Bcl-6蛋白表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征DLBCL患者DLBCL組織中Ki-67、Bcl-6蛋白表達(dá)情況的比較

不同性別、年齡、LDH水平、原發(fā)部位、IPI和Hans分型DLBCL患者DLBCL組織中Ki-67蛋白表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期、IPI≥2和近期療效為SD+PD的DLBCL患者DLBCL組織中Ki-67蛋白呈高表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.779、4.709、7.790，P＜0.05）。不同性別、年齡、原發(fā)部位、IPI和近期療效DLBCL患者DLBCL組織中Bcl-6蛋白表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；臨床分期為Ⅰ+Ⅱ期、正常LDH水平及GCB型DLBCL患者DLBCL組織中Bcl-6蛋白呈高表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.694、4.611、7.647，P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征DLBCL患者Ki-67、Bcl-6蛋白的表達(dá)情況

2.3 預(yù)后情況的比較

治療后，對(duì)所有患者隨訪3年，隨訪截止2019年10月30日。Ki-67蛋白高表達(dá)DLBCL患者的平均生存期分別為（31.49±1.70）個(gè)月，低于低表達(dá)DLBCL患者的（44.25±2.38）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.07，P＜0.01）；Bcl-6蛋白高表達(dá)DLBCL患者的平均生存期為（45.33±1.49）個(gè)月，高于低表達(dá)DLBCL患者的（25.23±2.01）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=41.13，P＜0.01）。（圖1、圖2）

圖1 Ki-67蛋白高表達(dá)（n=59）和Ki-67蛋白低表達(dá)（n=12）DLBCL 患者的生存曲線

圖2 Bcl-6蛋白高表達(dá)（n=58）和Bcl-6蛋白低表達(dá)（n=13）DLBCL 患者的生存曲線

2.4 DLBCL 患者預(yù)后影響因素的單因素分析

隨訪3年，71例DLBCL患者生存38例，單因素分析結(jié)果顯示，不同年齡、性別和原發(fā)部位DLBCL患者3年生存率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同臨床分期、LDH水平、Hans分型、IPI、Ki-67蛋白表達(dá)情況和Bcl-6蛋白表達(dá)情況DLBCL患者3年生存率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表3）

2.5 DLBCL 患者預(yù)后影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的臨床分期、LDH水平、Hans分型、IPI、Ki-67蛋白表達(dá)情況和Bcl-6蛋白表達(dá)情況作為自變量，DLBCL患者的生存情況作為因變量納入非條件多因素Logistic回歸模型分析，結(jié)果顯示，臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期、Hans分型為non-GCB型、Ki-67蛋白高表達(dá)、Bcl-6蛋白低表達(dá)是DLBCL患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。（表 4）

3 討論

DLBCL是淋巴瘤分類中發(fā)病率最高的亞型，其異質(zhì)性較大，且具有較寬的細(xì)胞譜系，且常常起病兇險(xiǎn)，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[7]?；熓荄LBCL的主要治療手段，誘導(dǎo)化療病情緩解后實(shí)施鞏固化療、放療聯(lián)合自體造血干細(xì)胞移植可以明顯提高患者的長(zhǎng)期生存率和總生存率[8]。相關(guān)研究顯示，40%～50%的DLBCL患者經(jīng)有效治療后近期生存率明顯提高，本研究生存分析結(jié)果顯示，Ki-67蛋白低表達(dá)和Bcl-6高表達(dá)DLBCL患者的生存期較長(zhǎng)，與既往研究結(jié)果類似。但仍存在部分死亡病例，且部分患者緩解后可出現(xiàn)復(fù)發(fā)，因此，本研究探討Ki-67、Bcl-6的表達(dá)與DLBCL患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

表3 DLBCL患者預(yù)后影響因素的單因素分析

表4 DLBCL患者預(yù)后影響因素的多因素分析

Ki-67是一種非組蛋白性核蛋白，主要存在于增殖細(xì)胞核中[9]。Ki-67在細(xì)胞增殖的G1、S、G2和M期中均有表達(dá)，但在靜止的G0期不表達(dá)[10]。Ki-67在細(xì)胞不同分裂階段表達(dá)情況不同的特點(diǎn)，對(duì)反映細(xì)胞分裂和增殖狀態(tài)有重要意義，可將其作為評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)增殖情況的敏感指標(biāo)。本研究顯示，DLBCL組織中Ki-67的高表達(dá)率達(dá)83.10%，明顯高于癌旁正常組織的9.86%，與DLBCL屬于侵襲性腫瘤密切相關(guān)。進(jìn)一步研究Ki-67與DLBCL患者預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Ki-67蛋白高表達(dá)DLBCL患者的平均生存期為（31.49±1.70）個(gè)月，低于低表達(dá)DLBCL患者的（44.25±2.38）個(gè)月，這可能是因?yàn)槟[瘤組織中凋亡細(xì)胞增多，導(dǎo)致更多的周圍細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，進(jìn)而使G0期細(xì)胞比例減少，導(dǎo)致Ki-67蛋白高表達(dá)[11]。而Ki-67蛋白高表達(dá)率的升高從側(cè)面反映了腫瘤的快速增殖及低組織分化[12]。

原癌基因Bcl-6位于3q27染色體，可編碼一個(gè)鋅指蛋白，主要促進(jìn)淋巴細(xì)胞分化和生發(fā)中心形成[13]。Bcl-6蛋白主要表達(dá)于正常的濾泡生發(fā)中心B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞，可抑制B淋巴細(xì)胞的終末分化[14]。本研究顯示，DLBCL組織中Bcl-6蛋白的高表達(dá)率為81.69%，分析其原因可能與體細(xì)胞的突變有關(guān)。陳文婷等[15]通過對(duì)163例初診DLBCL患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bcl-6的表達(dá)水平與DLBCL患者總生存期和無進(jìn)展生存期明顯相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，不同年齡、性別和原發(fā)部位DLBCL患者3年生存率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同臨床分期、LDH水平、Hans分型、IPI、Ki-67蛋白表達(dá)情況和Bcl-6蛋白表達(dá)情況DLBCL患者3年生存率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步多因素分析發(fā)現(xiàn)，Ki-67蛋白高表達(dá)、Bcl-6蛋白低表達(dá)是DLBCL患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。此外，本研究還對(duì)其他影響DLBCL患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期、Hans分型為non-GCB型是DLBCL患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。這可能是因?yàn)镵i-67、Bcl-6蛋白的異常表達(dá)可影響腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)、凋亡，導(dǎo)致患者出現(xiàn)不同臨床分期、癥狀從而影響預(yù)后，這些指標(biāo)在一定程度上可作為評(píng)估DLBCL患者預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述，Ki-67、Bcl-6在DLBCL患者中高表達(dá)，其表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)；臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期、Hans分型為non-GCB型、Ki-67蛋白高表達(dá)、Bcl-6蛋白低表達(dá)是DLBCL患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的有效指標(biāo)。