楊海波，王英華，宋 丹，程 果，方先珍， 閆若潛

(河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 鄭州 450000)

新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的一種禽類(lèi)的高度接觸性烈性傳染病，曾多次在世界范圍內(nèi)流行，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。新城疫被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office Interirnation Epizooties,OIE)列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病之一，被我國(guó)列為一類(lèi)動(dòng)物疫病[1]。NDV主要侵害雞和火雞，也可感染鴨、鵝等水禽，人偶爾也可感染[2，3]。禽感染 NDV 的主要表現(xiàn)為：病雞呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、黏膜漿膜出血。新城疫病毒高毒株，被認(rèn)為是一種人畜共患病毒，其潛伏期約48 h[4]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，新城疫病毒只有1個(gè)血清型、分為10個(gè)基因型[5]，在一些地區(qū)有基因Ⅷ型和Ⅸ型引起的散發(fā)流行，引起暴發(fā)流行的是基因Ⅶ型NDV[6]。新城疫流行范圍很廣，在我國(guó)大部分地區(qū)均有報(bào)道，該病流行的優(yōu)勢(shì)基因型為Ⅶ型，NDV的基因也在不斷地發(fā)生著變異，其變化呈生物多樣性[7]。

2019年3-6月份，從18個(gè)省轄市共采集禽病原學(xué)和血清學(xué)樣品5 753份，分別進(jìn)行了血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)，以期了解河南省雞群新城疫病毒的抗體水平和感染情況，為河南省禽場(chǎng)ND防控預(yù)警提供科學(xué)數(shù)據(jù)，減少ND的發(fā)生和流行。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年3月-6月份從河南省18個(gè)省轄市共采集5 753份樣品，其中病原學(xué)樣品3 532份，來(lái)自于114個(gè)場(chǎng)點(diǎn)(雞場(chǎng)97個(gè)，鴨場(chǎng)9個(gè)，鵝場(chǎng)5個(gè)，野鳥(niǎo)棲息地3個(gè))，血清學(xué)樣品2 221份，來(lái)自于74個(gè)雞場(chǎng)。采樣原則：每個(gè)省轄市隨機(jī)抽6個(gè)場(chǎng)點(diǎn)，包括 1個(gè)活禽交易市場(chǎng)、2個(gè)種禽場(chǎng) (含 1個(gè)肉種雞場(chǎng))、 1個(gè)商品禽場(chǎng)、1個(gè)水禽場(chǎng)、1個(gè)屠宰場(chǎng)的家禽進(jìn)行監(jiān)測(cè),水網(wǎng)密集區(qū)選擇1個(gè)野鳥(niǎo)棲息地。每個(gè)禽場(chǎng)隨機(jī)抽取30份樣品。

1.2 主要儀器與試劑

7500熒光定量PCR儀，由ABI公司生產(chǎn)；NP968全自動(dòng)核酸提取儀，由西安天隆科技有限公司生產(chǎn)；BIOgafe 12二級(jí)生物安全柜，由上海力申科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

核酸提取試劑盒(批號(hào)：E0119040111)，由蘇州天隆生物科技有限公司生產(chǎn)；新城疫病毒核酸檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20190307)，由中山達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)；新城疫抗原(批號(hào)：20180503)，由哈爾濱維科生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 檢測(cè)方法

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《新城疫診斷技術(shù)》[8]，采用血凝抑制試驗(yàn) (HI)檢測(cè)血清樣品；依據(jù)《新城疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法》(FKZX/S Y005-2017)檢測(cè)病原。

1.4 樣品的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)采集的血清樣品，用血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)新城疫病毒免疫抗體。HI抗體效價(jià)≥24，判定為個(gè)體合格；存欄禽群抗體合格率≥70%，判定為群體合格。將采集的咽喉/泄殖腔拭子、糞便樣品按照核酸提取試劑盒操作步驟進(jìn)行，取200μL待檢樣品，加入含胰酶的核酸提取板中，用磁珠法提取RNA，然后用熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)核酸進(jìn)行NDV檢測(cè)。

1.5 檢測(cè)結(jié)果的分析

血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果，在辦公軟件Excle 中錄入、整理并繪制表格，分別從時(shí)間分布、空間分布及群間分布方面進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總體檢測(cè)結(jié)果分析

共檢測(cè)74個(gè)場(chǎng)點(diǎn)的血清樣品，其中合格場(chǎng)群 74個(gè)，平均場(chǎng)群合格率為 100%；共檢測(cè)血清樣品2 221份，檢出合格樣品2 015份，雞新城疫的抗體平均合格率為90.72%，說(shuō)明我省新城疫免疫效果較好；病原學(xué)共檢測(cè)114個(gè)場(chǎng)點(diǎn)的拭子樣品，有2個(gè)場(chǎng)點(diǎn)檢測(cè)出新城疫病毒核酸陽(yáng)性，群體檢出率為1.7%，3 532份病原學(xué)樣品中共檢測(cè)出7份陽(yáng)性，個(gè)體陽(yáng)性率為0.19%。陽(yáng)性樣品主要集中在市場(chǎng)樣品和屠宰場(chǎng)樣品，其中市場(chǎng)樣品的檢出率最高,個(gè)體陽(yáng)性率為0.38%。

2.2 不同時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果分析

本次采集的樣品主要集中在3、4、5月份，抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，新城疫病毒抗體合格率最高的是3月份，合格率為100% ，其次是 5月份，抗體合格率是89.48%；4月份抗體合格率是88.91%。病原學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性檢出率最高的是5月份，共檢測(cè)出7份新城疫病毒陽(yáng)性，3月和4月份未檢出NDV陽(yáng)性樣品，出現(xiàn)差異的原因可能是，這三個(gè)月樣品數(shù)量分布不均勻。

2.3 不同區(qū)域的檢測(cè)結(jié)果分析

從全省5個(gè)區(qū)域的抗體檢測(cè)結(jié)果看，新城疫以豫南地區(qū)的抗體合格率最高(94.98%)，其次為豫東地區(qū)(93.88%)、豫中地區(qū)(92.29%)，豫北地區(qū)(86.84%)，豫西地區(qū)的抗體合格率最低(85.91%)；全省5個(gè)區(qū)域的病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，新城疫病毒主要在豫北地區(qū)有檢出，共檢測(cè)出7份新城疫病毒核酸陽(yáng)性，其他四個(gè)區(qū)域均未檢出，見(jiàn)表1。

表1 不同區(qū)域新城疫的血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.4 不同場(chǎng)點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果分析

不同監(jiān)測(cè)場(chǎng)點(diǎn)禽的平均免疫合格率進(jìn)行比較，種禽場(chǎng)抗體合格率最高(98.63%)，其次是商品場(chǎng)(98.45%)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)(96.67%)，屠宰場(chǎng)的抗體合格率最低(46.66%)；病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，商品場(chǎng)的檢出率最高，檢測(cè)出5份陽(yáng)性新城疫病毒，陽(yáng)性率為0.20%，農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)檢測(cè)出2份陽(yáng)性新城疫病毒，陽(yáng)性率為0.38%，詳見(jiàn)表2。種禽場(chǎng)、屠宰場(chǎng)及野禽棲息地樣品中未檢出新城疫病毒陽(yáng)性，可能是由于商品場(chǎng)的樣品基數(shù)相對(duì)較大。

表2 不同場(chǎng)點(diǎn)新城疫血清學(xué)和病原學(xué)監(jiān)測(cè)情況統(tǒng)計(jì)表

2.5 不同種屬家禽的檢測(cè)結(jié)果分析

血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，雞場(chǎng)的抗體合格率為97.83%。本次監(jiān)測(cè)3 532份禽拭子樣品，其中雞拭子2 925份，鴨咽泄拭子300份，鵝咽泄拭子268份，野禽拭子樣品39份。檢測(cè)結(jié)果顯示，2 925份雞咽泄拭子樣品共檢測(cè)出7份陽(yáng)性新城疫病毒核酸，陽(yáng)性率為0.24%，鴨、鵝和野禽的拭子樣品未檢出新城疫病毒核酸陽(yáng)性，詳見(jiàn)表3。

表3 新城疫病毒核酸檢測(cè)結(jié)果

3 討論

血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果提示，全省新城疫免疫效果比較好，整體合格率為97.83%，高于農(nóng)業(yè)部規(guī)定70%的標(biāo)準(zhǔn)。但是屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)的抗體合格率較低，存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，主要原因是農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和屠宰場(chǎng)的雞多數(shù)為養(yǎng)殖場(chǎng)淘汰的雞只，后期的免疫不到位，造成了雞體內(nèi)抗體含量較低。個(gè)別種禽場(chǎng)抗體合格率低，主要原因是僅僅免疫了1次疫苗。建議廣大養(yǎng)殖戶加強(qiáng)免疫，減少發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

新城疫是嚴(yán)重影響世界養(yǎng)禽業(yè)的傳染病，疫苗免疫是防控該病的重要措施。環(huán)境、宿主、疫苗選擇壓力等諸多因素綜合作用下，NDV在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生著變化[9]。研究表明，NDV 不同分離株之間有一定的抗原性差異，有的相互之間不能產(chǎn)生較好的交叉保護(hù)，會(huì)造成免疫失敗[10]。熒光定量RT- PCR 技術(shù)是檢測(cè)新城疫病毒的重要方法[11]。本次病原學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，我省的禽群有零星發(fā)病的現(xiàn)象，可能是免疫失敗導(dǎo)致的。盡管新城疫病毒只有一個(gè)血清型，但在疫苗的免疫壓力下，新城疫病毒也在發(fā)生著變異，出現(xiàn)了多種基因型，由于新城疫病毒疫苗種類(lèi)較多，應(yīng)該選擇符合當(dāng)?shù)亓餍袃?yōu)勢(shì)基因型的疫苗進(jìn)行免疫。

近年來(lái)，有關(guān)水禽感染新城疫病毒的病例和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)逐漸增多[12]，2009年，劉華雷等[13]分析1997-2005年從水禽中分離出的10株新城疫病毒的分子流行病學(xué)特點(diǎn)，認(rèn)為基因Ⅶ型NDV是造成我國(guó)近年來(lái)水禽發(fā)生新城疫的主要原因；2011年，徐家芳等[14]在發(fā)病天鵝的組織病料中檢測(cè)出新城疫病毒核酸；2012年，胡北俠等[15]在櫻桃谷鴨中成功復(fù)制出了基因Ⅶ型強(qiáng)毒。得出結(jié)論，NDV在感染宿主方面的確發(fā)生了很多新的變化，對(duì)鴨、鵝等水禽的致病性有明顯的增強(qiáng)。

此次監(jiān)測(cè)未檢測(cè)出水禽有感染新城疫病毒的現(xiàn)象，但是發(fā)現(xiàn)廣大水禽養(yǎng)殖戶對(duì)水禽新城疫認(rèn)識(shí)程度不夠，仍認(rèn)為新城疫病毒只感染家禽，對(duì)水禽危害不大，平時(shí)未免疫新城疫疫苗，存在水禽感染新城疫病毒的風(fēng)險(xiǎn)。 我們需要進(jìn)一步研究水禽在NDV傳播中的作用，提高廣大水禽養(yǎng)殖戶對(duì)新城疫的重視程度，養(yǎng)殖場(chǎng)要不斷提高生物安全措施，避免家禽和水禽的混合飼養(yǎng)，防止傳染病的種間傳播。此外，廣大水禽養(yǎng)殖戶應(yīng)該加強(qiáng)水禽新城疫病毒的免疫，相關(guān)部門(mén)要加強(qiáng)水禽中新城疫病毒的監(jiān)測(cè)。

4 結(jié)論

河南省新城疫病毒抗體總體合格率達(dá)到了90%以上，取得較好的防控效果。但部分養(yǎng)殖及流通環(huán)節(jié)的免疫水平較低，病原學(xué)檢測(cè)有零星陽(yáng)性樣品檢出，存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要繼續(xù)加強(qiáng)新城疫的科學(xué)防控，定期做好抽樣監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。本研究通過(guò)對(duì)河南省不同地區(qū)采集的禽類(lèi)樣品進(jìn)行血清學(xué)和病原學(xué)檢測(cè)，了解了全省的新城疫免疫抗體情況和新城疫病毒流行情況，為指導(dǎo)我省新城疫病的防控提供了科學(xué)依據(jù)。