□ 杜發(fā)祥 許菊霞 杜雪琴 繆樹婷 甘肅省張掖市高臺(tái)縣食品藥品檢驗(yàn)檢測中心

在我國，細(xì)菌性食物中毒中70%～80%是由沙門氏菌引起的，而且大多數(shù)來源于動(dòng)物性食品，沙門氏菌菌型繁多，分布廣泛，是重要的人畜共患病原體[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由沙門氏菌引起的食物中毒事件在世界各國的細(xì)菌性食物中毒種類中常列榜首[2]。通常沙門氏菌會(huì)通過污染食物引起食物中毒事件，人體受感染后在毒素作用下導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒，平均發(fā)病時(shí)間為12～24 h，愈后良好。沙門氏菌的傳播方式眾多，可通過肉、蛋、環(huán)境以及無癥狀帶菌者傳播，在食品餐飲業(yè)加工銷售過程中易受到污染，因此能否在食品和食物中毒事故調(diào)查中及時(shí)成功分離鑒別出該菌極為重要。本實(shí)驗(yàn)室結(jié)合本次能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總結(jié)食品中沙門氏菌檢測過程中的關(guān)鍵控制要素，討論控制操作中的問題。

1 材料和方法

1.1 待檢樣品

沙門氏菌驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)待檢樣品為：編號(hào) CODE0477、CODE0884、CODE0861的巧克力3份，樣品包裝具塞玻璃瓶密封包裝，寄送加冰袋，樣品接收時(shí)包裝完好無損壞。

1.2 培養(yǎng)基、試劑和材料

緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂與三糖鐵（TSI）瓊脂采購自廣東環(huán)凱微生物有限公司；蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑、尿素生化管（pH7.2）、氰化鉀 （KCN）生化管和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)生化管采購自北京路橋技術(shù)股份有限公司；沙門氏菌多價(jià)診斷血清采購于寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。無菌錐形瓶、試管等均有本實(shí)驗(yàn)室自行消毒后使用；微量移液器吸頭、無菌培養(yǎng)皿均為一次性使用材料。

1.3 儀器和設(shè)備

生化培養(yǎng)箱（SPX-250-Ⅱ上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）、均質(zhì)器（BagMixerp?400）、電子天平（AE523C上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、手提式壓力蒸汽滅菌鍋（DSX-280KB30上海申安醫(yī)療器械廠）、生物安全柜（HR40-ⅡA2）和顯微鏡（DSZ200000X重慶澳浦光電技術(shù)有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

中國食品藥品檢驗(yàn)研究院能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書、國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》。

1.4.1 預(yù)增菌

按照能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)要求，直接取待檢巧克力10 g樣品，置于盛有90 mL緩沖蛋白胨水（BPW）的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打2 min。直接放入培養(yǎng)箱內(nèi)（36±1） ℃培養(yǎng)18 h。

1.4.2 增菌

輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過的樣品混合物,移取1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL TTB內(nèi)，于（42±1）℃培養(yǎng)24 h。同時(shí)，另取1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL SC內(nèi)，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h。

1.4.3 分離培養(yǎng)

取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)BS瓊脂平板，（36±1）℃培養(yǎng)48 h；再取一環(huán)增菌液，劃線接種于一個(gè)XLD瓊脂平板上，（36±1）℃培養(yǎng)24 h，觀察各個(gè)平板上生長的菌落特征。

1.4.4 純培養(yǎng)和生化鑒定

從選擇性瓊脂平板上分別挑取2個(gè)可疑菌落，先做革蘭氏染色，然后再接種三糖鐵瓊脂、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h。接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的同時(shí)，直接接種蛋白胨水、尿素生化管（pH7.2）、氰化鉀（KCN）生化管，挑取的可疑菌落可直接進(jìn)行沙門氏菌多價(jià)診斷血清試探性凝集實(shí)驗(yàn)，觀察凝集結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落特征分析

觀察表1描述可知，編號(hào)為CODE0477、CODE0884的質(zhì)控樣品在BS瓊脂菌落為黑色菌落、周邊培養(yǎng)基無顏色變化，XLD瓊脂平板上都生長有黑色菌落，CODE0861在BS瓊脂菌落為中心帶光澤的黑色菌落，XLD瓊脂上為帶金屬光澤的黑色菌落，菌落形態(tài)都均有沙門氏菌菌落生長特性，由于缺少顯色培養(yǎng)基的培養(yǎng)篩選，3份樣品中均有可能生長沙門氏菌，需要進(jìn)一步生化反應(yīng)鑒別。

2.2 生化鑒定

按照表2生化反應(yīng)對照發(fā)現(xiàn)，三個(gè)樣品均分解葡萄糖、產(chǎn)氣、產(chǎn)硫化氫，賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽性（+），都為可疑沙門氏菌反應(yīng)特性。但CODE0477、CODE0884樣品呈尿素酶（+），靛基質(zhì)試驗(yàn)陰性（-），將可疑菌落再次純化接種，進(jìn)行尿素酶、氰化鉀、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)，仍為尿素陽性（+）、氰化鉀陰性（-）、賴氨酸脫羧酶陽性（+），對照國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》GB 4789.4-2016標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為可疑菌落有可能是沙門氏菌個(gè)別變種，需做血清學(xué)凝集試驗(yàn)確定。CODE0861樣品培養(yǎng)24 h仍然不發(fā)酵尿素（-），且氰化鉀陰性（-）、賴氨酸脫羧酶陽性（+），靛基質(zhì)陰性（-）是典型的沙門氏菌的生化反應(yīng)。

表1 生長特點(diǎn)

表2 生化反應(yīng)和血清凝集結(jié)果

2.3 血清凝集

對3份樣品在BS瓊脂和XLD瓊脂上生長的可疑菌落，先進(jìn)行沙門氏菌多價(jià)試探性血清凝集，結(jié)果顯示CODE0477、CODE0884不 凝 集（-），CODE0861凝集（+），將營養(yǎng)瓊脂純化的菌落進(jìn)行血清學(xué)凝集，結(jié)果顯示CODE0477、CODE0884 不凝集（-），CODE0861凝集（+），通過接種來提高瓊脂含量，培養(yǎng)和加熱消除Vi抗原等方法，反復(fù)凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示CODE0477、CODE0884 仍不凝集（陰性），由于缺乏分型鑒定血清，沒有繼續(xù)對CODE0861進(jìn)行鑒定分型。綜合菌落生長特性、生化反應(yīng)、血清凝集試驗(yàn)結(jié)果分析，最終判定CODE0477、CODE0884樣品中為非沙門氏菌，而CODE0861樣品中為典型沙門氏菌。

3 討論

能力驗(yàn)證是有效提升檢測能力的途徑，也是對實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、操作程序、技術(shù)進(jìn)行質(zhì)量控制的重要手段。本次能力驗(yàn)證樣品是巧克力，目的菌是沙門氏菌，按照國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)步驟操作即可，在分離培養(yǎng)時(shí)由于缺少沙門氏菌顯色平板，不能有效直觀挑選可疑菌落，對后期生化反應(yīng)和血清凝集試驗(yàn)帶來一定困難，挑選可疑菌落時(shí)應(yīng)選擇具有豐富經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)人員進(jìn)行操作，可先做試探性玻片凝集試驗(yàn)，以增加挑選菌落的準(zhǔn)確性，對菌落形態(tài)較為典型，但試探性凝集為陰性的菌落應(yīng)進(jìn)一步生化鑒定和多價(jià)凝集試驗(yàn)，由于H抗原發(fā)育不良，造成假陰性的結(jié)果。生化鑒定中發(fā)現(xiàn)CODE0477、CODE0884兩個(gè)樣品發(fā)酵尿素非常迅速，這一特性需在食物中毒事故調(diào)查分離病原菌時(shí)引起高度重視，因近年來兩種及以上病原菌引起的食物中毒案例已有報(bào)道，為避免漏診一定要結(jié)合營養(yǎng)瓊脂菌落生長情況進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定分析，通過此次能力驗(yàn)證，在營養(yǎng)瓊脂菌液中對這兩個(gè)迅速發(fā)酵尿素的樣品進(jìn)行觀察，未發(fā)現(xiàn)有“遷徙狀生長”現(xiàn)象，可以初步排除變形桿菌的干擾。