徐紅紅 黃世穩(wěn) 梁凌玲

摘 要：生活在我國(guó)西南部的植物九里香具有解毒消腫等多種功效，是我國(guó)一類常用的中草藥材，其中O-甲基類黃酮因其酮含量高，穩(wěn)定且利用率高等原因成為九里香中主要的功能成分之一，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)類黃酮具有催化作用的O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為基因的特點(diǎn)及功能做進(jìn)一步分析，并通過對(duì)九里香的RNA提取為該基因的后續(xù)克隆做準(zhǔn)備。同時(shí)利用現(xiàn)代生物學(xué)軟件對(duì)類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行生物學(xué)分析，為該基因的后續(xù)表達(dá)研究做奠定基礎(chǔ)。

九里香（Murraya exotica）又名九秋香，為蕓香科（Rutaceae）九里香屬（Murraya）植物，主要分布于我國(guó)廣西、貴州等溫?zé)岬貐^(qū)，有解毒消腫、行氣活血、麻醉止痛等功效，其中酮類化合物是其重要的藥用價(jià)值所在，其中多羥基黃酮類化合物和黃酮苷類化合物，相對(duì)于類黃酮的脂溶性及水溶性較差，導(dǎo)致其利用率及應(yīng)用受到限制，經(jīng)甲基分子修飾過的類黃酮化合物無論在脂溶性還是水溶性方面都更好，生物利用度也更高[2-3]，本實(shí)驗(yàn)將對(duì)O-甲基修飾的類黃酮轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

1.材料和方法

1.1植物采集

植物采集于廣西省百色市右江區(qū)內(nèi)提取莖、葉片等部分保存在液氮中備用進(jìn)行總RNA的提取。

1.2改良的SDS法提取總RNA

（1）將材料迅速放入預(yù)冷的研缽里，并加入少量VC作為植物抗氧化劑，不斷研磨直至成粉末狀倒入管中;（2）向管中分別加入320?L氯仿、320?L Tris-酚和720?L SDS溶液制成懸液，震蕩12min后，11000r/min離心8min;（3）吸取上清液至新離心管中，分別加入320?L氯仿和320?L Tris-酚，震蕩8min后12000r/min離心8min;（4）重復(fù)上一步;（5）吸上清液加入同樣體積的氯仿溶液，震蕩8min后離心8min;（6）再次吸上清液，向管中加入一半體積的LiCl溶液和一半體積的無水乙醇，搖勻后于-20℃靜置40min，13000r/min離心20min，留沉淀;（7）將沉淀在75%乙醇溶液中洗滌2次，晾干至無味，溶解于DEPC水溶液 -80℃保存;（8）利用核酸濃度檢測(cè)儀檢測(cè)總RNA的濃度并用1.0%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。

1.3 類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的信息學(xué)分析

通過NCBI 軟件比對(duì)，沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)九里香該基因的研究，因此選擇了同源性較高的大豆類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（ID 114422719）進(jìn)行分析，為后續(xù)的九里香該基因的克隆奠定基礎(chǔ)，分別利用了NCBI的BLAST檢索軟件分別對(duì)大豆類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的開放閱讀框和氨基酸序列同源性比對(duì)進(jìn)行分析（基因序列為圖1-1）;運(yùn)用ProtParam軟件預(yù)測(cè)該基因的基本理化性質(zhì);利用ProtScale軟件預(yù)測(cè)基因編碼蛋白的親疏水性分析;利用PSORTII Prediction軟件對(duì)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位和功能進(jìn)行預(yù)測(cè);蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建由SWISS-MODEL和NCBI中blast比對(duì)軟件完成。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1九里香總RNA的提取

九里香中普遍含有酚類、固醇類、萜類等代謝產(chǎn)物，所以提取總RNA過程較為困難，因此通過多次實(shí)驗(yàn)最終通過改良后的SDS法進(jìn)行提取，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳方法進(jìn)行檢測(cè)。

2.2類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的信息學(xué)分析

2.2.1.基因的基本理化性質(zhì)

利用ProtParam軟件對(duì)類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行理化性質(zhì)分析，該基因全長(zhǎng)1711 bp，ORF長(zhǎng)901 bp，共編碼283個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為31 kD，理論等電點(diǎn)為6.07，其中負(fù)電荷殘基數(shù)為30，正電荷殘基數(shù)為26，不穩(wěn)定系數(shù)為39.88<40，表示該蛋白為穩(wěn)定性蛋白。

2.2.2類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的親疏水性分析

基因的親疏水性表明氨基酸的第251位的疏水性最高，氨基酸的第1251位的為親水性最低，由圖可知該蛋白的疏水性氨基酸明顯多于親水性氨基酸，因此類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白為疏水性蛋白。

2.2.3類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶的亞細(xì)胞定位及功能預(yù)測(cè)

利用NetPhos2.0軟件對(duì)蛋白的亞細(xì)胞進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)的幾率為69.6%，定位于核能的幾率為13.0%，定位于線粒體的幾率為8.7%，定位于分泌系統(tǒng)囊泡和液泡的幾率為4.3%，說明該基因編碼的蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，常以二聚體形式存在，并催化類黃酮的的O-甲基化反應(yīng)，與豆科植物的固氮作用有關(guān)。

2.2.4類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過SWISS-MODEL軟件對(duì)蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，如圖2-4所示，蛋白的立體結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲。

2.2.6類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

通過NCBI軟件中BLAST同源性比對(duì)將發(fā)現(xiàn)該基因的同源性較強(qiáng)，其中主要與大豆，野葛根，菜豆紫花苜蓿和花生的類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因同源性最高。

3.結(jié)果分析

總RNA提取質(zhì)量的好壞是基因克隆實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，也是最重要的步驟之一，提取的結(jié)果將直接影響到后續(xù)的克隆實(shí)驗(yàn)的成敗。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)SDS法進(jìn)行改良成功提取了九里香總RNA，結(jié)果顯示28sRNA和18sRNA條帶清晰完整，且第一條帶的亮度約為第二條帶亮度的2倍，通過過核酸蛋白濃度檢測(cè)，A260/A280比值為1.96，結(jié)果介于1.8-2.0之間，說明提取的總RNA相對(duì)純度較高，可以利用和保存用于后續(xù)的克隆實(shí)驗(yàn)。生物信息學(xué)是融合多種學(xué)科的理論及應(yīng)用方法而產(chǎn)生的綜合分析學(xué)科 [4]，本實(shí)驗(yàn)利用信息學(xué)軟件對(duì)大豆類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)該基因與野葛根、菜豆、紫花苜宿、花生等多種植物的O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因有高同源性，根據(jù)基本理化性質(zhì)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、親疏水性等多種性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明該基因全長(zhǎng)1711bp，開放閱讀框長(zhǎng)901bp，理論等點(diǎn)點(diǎn)為6.07，說明類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶為中性蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為31 kD，為穩(wěn)定性蛋白，且疏水性很強(qiáng)。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)該蛋白主要以螺旋和卷曲組成，三級(jí)立體結(jié)構(gòu)分析該蛋白呈現(xiàn)卷曲狀，通過生物信息學(xué)分析，該基因主要是通過是催化S-腺苷甲硫氨酸中的甲基轉(zhuǎn)移到類黃酮的羥基上，從而增加其穩(wěn)定性和脂溶性，是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物之一。

參考文獻(xiàn)

[1]茶樹類黃酮 O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及原核表達(dá)分析馬成英，呂海鵬，林智，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)2013，46（2）：325-333

[2]Zhou DaYong，Zhang Xiu Li.UPLC /Q-TOFMS /MS as a powerful technique for rapid identification of polymethoxylated flavones in Fructus Aurantii[J].J Pharm Biomed Anal，2009（ 50）： 2.

[3]涂華，陳碧瓊，張燕軍.天然類黃酮物質(zhì)的提取工藝研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17 （6） ： 277.

[4]安曼云.藥用植物基因資源的生物信息學(xué)研究[J]建筑實(shí)踐，2019，38，（17）