刁歡，張娟娟，趙紅，賀真真

（安徽新華學院藥學院，安徽合肥230088）

鐵是人體的必需營養(yǎng)素，是非常容易引起代謝紊亂的元素。鐵主要在人體內(nèi)攜帶和輸送O2和CO2；可以增強免疫功能；可以保持正常造血功能以及參與人體新陳代謝等[1-2]。缺鐵會引起各種疾病，如缺鐵性貧血（iron deficiency anemia，IDA），同時還會引起免疫力、抵抗力低下等問題。我國IDA的發(fā)生率比較高，是我國重要的公共營養(yǎng)衛(wèi)生問題，嚴重影響人類的健康，兒童和孕婦缺鐵現(xiàn)象相對更加嚴重。IDA增加了妊娠高血壓的發(fā)生率，還可對兒童的大腦發(fā)育造成不可逆的損傷[3]。一般可通過口服補鐵，靜脈注射鐵或聯(lián)合營養(yǎng)干預來治療IDA，臨床上取得了顯著效果，但在患者依從性、效率和不良反應方面仍存在顯著差異。因此，現(xiàn)有的補鐵劑還需要加以優(yōu)化，并需開發(fā)出副作用少、利用率高、且能被人體快速吸收和利用的口服新型補鐵劑。

當前國內(nèi)外大多探究的是一類以多糖為載體、螯合Fe3+后形成的配合物，以Fe3+為中心的多糖鐵現(xiàn)已成為一種新型的口服補鐵劑。在1990年之后，右旋糖酐鐵在美國普遍用于醫(yī)治IDA，其對腸道無刺激，之后以Fe3+為中心、含多羥基的多糖類為配體的多糖鐵復合物成為新研究熱點。近年來，很多學者用中藥或食品所含多糖合成多糖鐵復合物，如大棗、玉米、茶葉、人參、二色補血草多糖鐵等[4-6]。多糖鐵具有較強的還原性，是一種新型的鐵補充劑[7]。多糖鐵配合物以非游離形態(tài)出現(xiàn)，不但可以避免胃腸道損傷，還可以在體內(nèi)還原成Fe2+被吸收利用。多糖鐵配合物和傳統(tǒng)的補鐵劑相比較而言，前者容易被人體攝取，具有較強絡合Fe3+能力，對胃腸道的不良反應較弱，況且當Fe3+釋放之后，配體多糖增強人體免疫能力，對細胞無損害，可以完全攝取。多糖鐵可以分子方式存在于人體中，并具備水溶性、沒有腸道刺激性、無毒性等優(yōu)勢。

克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）的胞外多糖是一種非常好的免疫調(diào)節(jié)劑，具備高質(zhì)量、不良反應少等特征[8]。此類菌的大多數(shù)胞外多糖具備絮凝活性和重金屬的吸附能力。Sugihara等利用K.oxytoca TMN3發(fā)酵提取胞外多糖，并對此進行免疫活性的研究，結(jié)果顯示該多糖對小鼠關節(jié)炎有免疫效果[9]。多糖與鐵元素二者結(jié)合在一起，有望成為有一種新型補鐵劑，滿足人們的需要。

當前尚未發(fā)現(xiàn)微生物胞外多糖和鐵螯合的有關研究報道，本論文通過研究制備微生物胞外多糖鐵的最佳工藝，為進一步開發(fā)其螯合物提供重要依據(jù)，并為利用微生物胞外多糖鐵配合物開發(fā)臨床補鐵劑類藥物提供科學依據(jù)。本文擬通過研究克雷伯氏菌胞外多糖鐵的制備工藝，實現(xiàn)其與鐵的有效螯合，并獲得有望成為新型鐵補充劑的多糖鐵。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種：克雷伯氏菌種由安徽農(nóng)業(yè)大學生物科技樓613實驗室，從白酒廠活性污泥中篩選而來。

種子培養(yǎng)基（nutrient broth medium，NB）：牛肉膏5 g、NaCl 5 g、蛋白胨 10 g，加 H2O 1 000 mL，自然 pH值。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、酵母膏0.5 g、K2HPO45.0 g、KH2PO42.0 g、MgSO40.2 g、NaCl 0.1 g、硫酸銨0.1 g、尿素 0.5 g、水 1 000 mL。

ZHP-100型振蕩培育箱：常州諾基儀器有限公司；UV1000型單光束紫外/可見分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；DHG-9101.3A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海三發(fā)科學儀器有限公司；FA2004N型電子天平：上海箐海儀器有限公司；XFS-280型手提式壓力蒸汽滅菌器：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國宇儀器制造有限公司；離心機：蘇州玖世器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 克雷伯氏菌胞外多糖的提取

克雷伯氏菌胞外多糖粗提步驟：發(fā)酵培養(yǎng)液→離心、去菌體細胞→無水乙醇添加倍量→4℃沉淀過夜放置→離心，取沉淀→再溶解→Sevage去蛋白→透析后再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍真空干燥→初步獲得微生物絮凝劑的粗品。

克雷伯氏菌株按照1%接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150 r/min、培養(yǎng)48 h，制備細菌發(fā)酵液。取發(fā)酵液50 mL經(jīng)3 000 r/min離心15 min，將上清液置于三角瓶中，然后按照上述方法進行胞外多糖提取，獲得多糖粗品[10]。

1.2.2 克雷伯氏菌胞外多糖的純化

利用Sevage試劑法去除克雷伯氏菌胞外多糖粗品中蛋白質(zhì)成分，經(jīng)透析法去除鹽、有機溶劑和部分生物小分子雜質(zhì)，再利用凝膠層析法進行深度純化。葡萄糖凝膠為Sephadex G-200，層析柱規(guī)格為40 cm×2.5 cm。

1.2.3 克雷伯氏菌多糖鐵螯合物的制備

稱取克雷伯氏菌胞外多糖純品，按照一定質(zhì)量比加入檸檬酸三鈉，用10 mL蒸餾水溶解，再加入足夠0.1 mol/L的FeCl3，調(diào)節(jié)pH值在7～8之間，可以看到有紅棕色沉淀的生成，當反應中產(chǎn)生的沉淀不再溶解時，停止添加FeCl3溶液，此時說明已反應完全；之后70℃水浴1 h，并不停攪拌；再4 000 r/min離心5 min，取上清液，加3倍95%乙醇，再離心；沉淀分別用無水乙醇、95%乙醇和無水乙醚3種有機溶劑洗滌，之后再真空干燥，制得粗品[11]。

1.2.4 鐵標準曲線的制作

采用鄰菲羅啉比色法[12]，取8個50 mL容量瓶，按順序準確加入 0、4.0、6.0、8.0、12.0、14.0、18.0、20.0 mL的鐵標準溶液。再分別加入10%的乙酸鈉溶液8 mL、10%的鹽酸羥胺溶液1 mL以及0.1%的鄰菲羅啉溶液10 mL進行反應，蒸餾水定容后搖勻，靜置15 min，測510 nm處吸光度值，并作出回歸方程。

1.2.5 樣品中鐵含量的測定

稱量一定的干燥多糖鐵配合物溶于蒸餾水中，50 mL容量瓶定容，即制得待測胞外多糖鐵溶液。

取多糖鐵溶液1 mL放入50 mL容量瓶，分別加入10%的鹽酸羥胺溶液2 mL和10%的鹽酸溶液1 mL，常溫（25℃左右）下反應1 h，然后按順序加入10%的乙酸鈉溶液10 mL和0.15%的鄰二氨菲溶液4 mL，計算鐵的含量，方法同 1.2.4[11，13]。

1.2.6 螯合試驗的單因素考察

在微生物胞外多糖鐵螯合的試驗研究過程中發(fā)現(xiàn)，螯合物中鐵含量受多糖和檸檬酸三鈉加入量的比例、螯合時間、螯合溫度及溶液pH值影響較大，所以對這些影響因素再進行具體的單因素考察，最后得到最佳制備工藝范圍。

胞外多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比：檸檬酸三鈉作為催化劑對多糖鐵的螯合作用有一定的影響。設置不同質(zhì)量比 2∶1、3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1、6 ∶1進行探究。螯合時間：設置 0.5、1、1.5、2、2.5 h 5 個不同時間進行探究。螯合溫度：設置 40、50、60、70、80℃ 5個不同的螯合溫度進行探究。溶液pH值：在5個不同pH值6、7、8、9、10的條件下進行探究。根據(jù)上述的初步試驗進行多糖鐵的螯合，最后通過鄰菲羅啉法測定樣品中的鐵含量。

1.2.7 正交試驗及其驗證

按照1.2.3的試驗方法進行螯合，測定各組樣品的鐵含量，并經(jīng)過正交數(shù)據(jù)分析獲得最佳制備工藝條件，因素水平表見1。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表Table 1 L9（34）horizontal table of factors in orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵標準曲線的繪制

鐵的標準曲線見圖1。

圖1 鐵的標準曲線Fig.1 Standard curve of iron

根據(jù)鐵標準曲線可以得到回歸方程：y=0.003 9x+0.005 2，相關系數(shù)R2=0.996 7。由圖1可知，鐵濃度在0 μg/mL～200 μg/mL 范圍內(nèi)，線性關系良好。

2.2 單因素考察

2.2.1 胞外多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比對鐵含量的影響

胞外多糖與檸檬酸三鈉按質(zhì)量比分別為2∶1、3∶1、4 ∶1、5∶1、6∶1，在 pH 值為 8、70℃條件下水浴 1h，并根據(jù)上述步驟進行螯合，得出結(jié)果見圖2。

圖2 胞外多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比對產(chǎn)品中鐵含量的影響Fig.2 Effect of the mass ratio of polysaccharide to trisodium citrate on iron content in products

由圖2可知，克雷伯氏菌胞外多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比因素影響大，當質(zhì)量比小于3∶1時，不利于螯合反應的進行，當質(zhì)量比大于4∶1時，其含鐵量逐步減小，檸檬酸三鈉在反應體系中作為催化劑，添加量過多過少，均會影響反應體系效率，故選擇克雷伯氏菌胞外多糖與檸檬酸三鈉的最佳質(zhì)量比為3∶1。

2.2.2 螯合時間對產(chǎn)品中鐵含量的影響

在最佳質(zhì)量比3∶1的條件下，選擇pH值為8、70 ℃的條件下水浴 0.5、1、1.5、2、2.5 h 進行螯合反應。結(jié)果見圖3。

圖3 螯合時間對產(chǎn)品中鐵含量的影響Fig.3 Effect of chelating time on iron content in products

由圖3可知，反應1 h時，鐵含量達到最高，但隨著時間的增加，鐵含量迅速下降。因為當反應達到一定的時間，反應完全，繼續(xù)反應，易使螯合物分離，得到的鐵含量也降低。因此，最佳螯合時間選擇為1 h。

2.2.3 螯合溫度對產(chǎn)品中鐵含量的影響

將胞外多糖和檸檬酸三鈉以3∶1的質(zhì)量比分別在 40、50、60、70、80 ℃、pH 值為 8 的條件下水浴 1 h，并根據(jù)初步試驗進行螯合，結(jié)果見圖4。

圖4 螯合溫度對產(chǎn)品中鐵含量的影響Fig.4 Effect of chelating temperature on iron content in products

由圖4可知，隨著溫度的升高，所得鐵含量先降低后增加，當螯合溫度為60℃時達到最大值，然后鐵含量迅速降低，當反應溫度過高時，離子振動比較強烈，不利于螯合反應的進行。反應溫度過低，則很難進行螯合反應。因此最佳螯合溫度為60℃。

2.2.4 溶液pH值對產(chǎn)品中鐵含量的影響

按照胞外多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比3∶1，螯合溫度 60 ℃，溶液 pH 值分別為 6、7、8、9、10，水浴 1 h，產(chǎn)品中鐵含量的測定結(jié)果見圖5。

圖5 螯合pH值對產(chǎn)品中鐵含量的影響Fig.5 Effect of chelating pH on iron content in products

當pH值高于7時，反應體系中離子強度過大，阻礙反應的進行。當pH值較低時，則反應氫離子濃度增大，導致螯合反應不完全。當反應液pH值為7時，所得含鐵量最高，為最佳螯合pH值。

2.3 正交試驗

L9（34）正交試驗結(jié)果見表2。

表2 L9（34）正交試驗結(jié)果Table 2 L9（34）Orthogonal test results

續(xù)表2L9（34）正交試驗結(jié)果Continue table 2L9（34）Orthogonal test results

從表2可以得到：極差值R可以看出影響克雷伯氏菌胞外多糖與三價鐵螯合效果從大到小依次為D>C>B>A，即克雷伯氏菌胞外多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比>螯合時間>螯合溫度>溶液pH值，最佳的試驗組合為A2B2C1D2，即克雷伯氏菌胞外多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比為3∶1，反應時間為0.5 h，溫度為60℃，溶液pH值為7。經(jīng)驗證在這種條件下，所得螯合物的含鐵量最高為2.88%，大于正交試驗第2組（A1B2C2D2）的結(jié)果。

3 結(jié)論

通過單因素和正交試驗發(fā)現(xiàn)，影響克雷伯氏菌胞外多糖與三價鐵螯合效果從大到小依次為D>C>B>A，得出最佳螯合試驗組合為A2B2C1D2，即克雷伯氏菌胞外多糖與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比為3∶1，螯合反應時間為0.5 h，溫度為60℃，溶液pH值為7。經(jīng)驗證，在此條件下所得的含鐵量最高為2.88%。

本研究制得的多糖鐵中鐵含量最高為2.88%，與植物多糖鐵的含量有一定差距。當歸多糖鰲合鐵的能力差異較大，試驗通過高價鐵鹽的鑒別反應，得出鐵含量可達10%～40%[14]；黨參多糖也可在堿性條件下合成黨參多糖鐵，且含鐵量可達19.9%[15]；在pH 4.1～12.6的條件下，茯苓多糖與鐵易鰲合，且鰲合鐵的鐵含量達6.33%[16]。黃芪多糖與鐵螯合力較強，形成的復合物中鐵含量可達到20.45%[17]?；覙浠ǘ嗵窃?0℃，螯合0.5 h，且溶液pH值為8時，可制得灰樹花多糖鐵的螯合物，鐵含量最高為3.08%[11]。天麻多糖鐵經(jīng)響應面法優(yōu)化制備工藝后，螯合物中鐵含量為33.48%[18]。不同多糖原料螯合鐵后得到的螯合物中鐵元素含量差異較大[19-20]。本研究中微生物胞外多糖與鐵離子可能未充分螯合，也可能是由于胞外多糖提純程度不足等導致螯合率不高。但本研究開拓了一個新的螯合領域，克雷伯氏菌胞外多糖螯合鐵有望成為一種新的補鐵劑，但其結(jié)構(gòu)分析和安全性驗證試驗還需要進一步研究。