孫 嬌 聶 力① 苗 亮 陳 炯，

(1. 寧波大學海洋學院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室 寧波 315211； 2. 寧波大學海洋學院 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室 寧波 315832)

固有免疫是抵抗病原體入侵的第一道防線(Lemaitreet al， 1996)。宿主通過免疫反應(yīng)來阻止病原體的感染與復制， 并將病原徹底清除。這種反應(yīng)的前提是固有免疫系統(tǒng)的模式識別受體(pattern recognition receptor， PRR)識別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecule patterns， PAMPs)， 發(fā)生受體配體反應(yīng)， 從而誘導產(chǎn)生一系列相關(guān)的細胞因子來介導宿主的抗病原機制(Uematsuet al， 2006)。

酪氨酸激酶蛋白(protein tyrosine kinase， PTK)是一類具有酪氨酸激酶活性的蛋白質(zhì)， 它們能催化蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基使其發(fā)生磷酸化反應(yīng)， PTK 包括受體型和非受體型兩種(Huanget al， 2005)。脾臟酪氨酸激酶(SYK)是一種非受體型酪氨酸激酶(non-receptor tyrosine kinase， NRTK)， 它與ZAP-70 關(guān)系最近， 同屬SYK 家族(Bolenet al， 1997)。來自細胞外的信號通過SYK 到達細胞質(zhì)從而介導一連串信號轉(zhuǎn)導過程(Bertonet al， 2005)。SYK 含有N 端的兩個SH2 結(jié)構(gòu)域和一個C 端激酶結(jié)構(gòu)域(Wong， 2005)。免疫受體信號需要SYK 的激酶活性以及兩個SH2 結(jié)構(gòu)域進行傳導。SYK 的激酶結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)的靜息狀態(tài)下是不活躍的， 但是可以通過將兩個SH2 結(jié)構(gòu)域結(jié)合到雙磷酸化的ITAM 上而被激活(Mócsaiet al， 2010)。

研究表明， SYK 在信號轉(zhuǎn)導過程中至關(guān)重要。在B 細胞信號轉(zhuǎn)導中， SYK 被激活后進一步激活鳥嘌呤核 苷 交 換 因 子(guanine nucleotide exchangefactor， GEF)， GEF 激活Ras 和Rac， 經(jīng)促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases， MAPK)途徑激活相關(guān)基因 (Buhlet al， 1997)。在T 細胞信號轉(zhuǎn)導中， SYK 可與磷酸化ITAM 結(jié)合， 進而啟動下游pre-T 細胞受體信號轉(zhuǎn)導(Palacioset al， 2007)。在Fc 信號轉(zhuǎn)導中， SYK 參與了FcεRI 介導的Ca2+內(nèi)流和分泌、細胞因子產(chǎn)生、脫粒等代謝過程(Zhanget al， 1996)。整合素是一個異二聚體跨膜受體家族， 參與白細胞粘附和遷移等， 在缺乏SYK 的中性粒細胞(Attilaet al， 2006)、單核細胞、巨噬細胞(Vineset al， 2001)、血小板(Obergfellet al， 2002)和破骨細胞(Zouet al， 2008)中， 整合素介導的信號轉(zhuǎn)導受到抑制。同時， SYK 還調(diào)控了病原體活化的先天免疫信號通路。在真菌識別方面， Dectin-1 與β-葡聚糖結(jié)合后促使SYK 活化， 隨后MAPK、NF-κβ 發(fā)生磷酸化被激活， 并促進TNF-α、IL-6、IL-10 等炎癥細胞因子的分泌， 增強抗真菌免疫能力(Drummondet al， 2011)。除此之外， SYK 還可以識別組織損傷， 研究發(fā)現(xiàn)CLEC9A 與SYK 偶聯(lián)后能夠識別細胞損傷相關(guān)分子并介導下游信號轉(zhuǎn)導(Sanchoet al， 2009)。

相比于在哺乳動物中較深透的研究， SYK 在硬骨魚中的功能研究相對較少較淺。雖然在石斑魚(Epinephelus coioides)(Moet al， 2016)、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)(Bianet al， 2018)等硬骨魚中有所報道， 但是研究均集中在對該蛋白的生物信息學分析、不同應(yīng)激條件下組織表達水平的研究， 而對其信號通路方面的研究， 特別是硬骨魚類SYK 是否也能像哺乳動物一樣激活MAPK 信號通路的研究幾乎未有涉及。

香魚(Plecoglossus altivelis)是東亞地區(qū)重要的經(jīng)濟魚類(史雨紅等， 2017)。在香魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中， 由鰻弧菌(Vibrio anguillarum)引起的細菌性疾病是造成損失的主要原因(Luet al， 2016)。考慮到SYK 在免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用， 研究香魚SYK(PaSYK)的結(jié)構(gòu)功能和活化的信號通路對后續(xù)的免疫防治至關(guān)重要。本研究分析了香魚SYK 基因的序列特征及其進化地位； 研究了不同健康組織及鰻弧菌感染后免疫組織中PaSYK 基因mRNA 的表達變化； 采用激光共聚焦技術(shù)確定了PaSYK 的亞細胞定位； 除此之外， 研究了PaSYK 對MAPK 信號通路的活化作用及對炎癥細胞因子表達的影響， 從而分析其在進化過程中功能的保守性。

1 材料與方法

1.1 實驗用香魚

本研究使用的香魚(Plecoglossus altivelis)購自浙江省寧波市寧?？h某漁場， 選擇體重40—50g 的健康魚。實驗前在20—22°C 的循環(huán)水系統(tǒng)中暫喂養(yǎng)兩周。所有實驗均按照中國實驗動物管理法進行， 并經(jīng)寧波大學動物倫理委員會批準。

1.2 PaSYK 基因cDNA 序列測定及分析

提取香魚健康組織的RNA 并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。從香魚頭腎單核/巨噬細胞(Monocyte/macrophage， MO/MΦ)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得PaSYK 序列。使用 Primer 5.0 軟件設(shè)計特異性引物(SYK F1/R1， 表1)， 以獲得的cDNA 為模板擴增其開放閱讀框(ORF)， 然后進行克隆和測序。PCR 反應(yīng)體系如下： cDNA 1μL， 上下游引物各1μL， dNTP (2.5mmol) 3.5μL， 10 × La Buffer 2.5μL， La Taq 0.25μL， ddH2O 15.75μL。PCR 程序如下： 預(yù)變性94°C 2min； 變性94°C 30s， 退火56°C 30s， 延伸72°C 2min， 30 個循環(huán)； 延伸72°C 10min。使用BioEdit 軟件將克隆的SYK 蛋白質(zhì)序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫進行比對。使用ProtParam 在線分析其分子量和等電點。使用Clustal W 軟件對PaSYK進行多重序列比對和同源性分析。使用 MEGA 6.0軟件以鄰接法(NJ)制作分子系統(tǒng)進化樹。本研究中使用的序列如表2 所示。

1.3 真核表達及熒光載體構(gòu)建

利用 Primer 5.0 軟件分別設(shè)計真核表達引物(SYK F2/R2)及熒光載體引物(SYK F3/R3)， PCR 擴增獲得相應(yīng)片段。將獲得的片段分別利用NotI/SfaA I以及EcoR I/BamH I 進行雙酶切， 克隆至真核表達載體pcDNA3.1-flag 及綠色熒光載體pEGFP-N1 上， 構(gòu)建真核表達質(zhì)粒及熒光表達質(zhì)粒。構(gòu)建的所有質(zhì)粒均經(jīng)測序驗證。使用EZNA?質(zhì)粒Midi 試劑盒(Omega Bio-Tek， 美國)制備用于轉(zhuǎn)染的無內(nèi)毒素質(zhì)粒。

表1 PCR 擴增和RT-qPCR 所用引物及序列 Tab.1 Oligonucleotide primers used for PCR and RT-qPCR

表2 研究中所用到的SYK 蛋白序列信息 Tab.2 SYK protein sequences used in this study

續(xù)表

1.4 鰻弧菌感染與組織收集

鰻弧菌培養(yǎng)方法參考文獻(Zhanget al， 2018)。簡述如下： 把鰻弧菌接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中， 28°C 恒溫搖床過夜培養(yǎng)； 按照1︰100 的比例繼續(xù)擴大培養(yǎng)， 在對數(shù)生長階段收集菌體后用無菌的PBS 洗滌、計數(shù)， 并用PBS 將菌體稀釋至最適濃度。感染組的每只香魚腹腔注射 100μL 含有 1.2×104colony forming units (CFUs)鰻弧菌的PBS， 對照組的香魚注射等量的PBS。在感染后4、8、12、24 和48hpi (hours post infection)收集香魚的鰓、脾、頭腎、肝和腸進行RNA提取。此外， 收集腸、脾、肝、鰓、頭腎和皮膚等健康組織提取RNA 并進行組織表達分析。

1.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

RT-qPCR 方法參考文獻(Chenet al， 2016)。簡述如下： 香魚組織或細胞的總RNA 抽提采用RNAiso試劑(TaKaRa， 大連)， 反轉(zhuǎn)錄成cDNA 放在-20°C 冰箱備用。以上述cDNA 為模板， 采用SYBR 預(yù)混料Ex Taq DNA 聚合酶(TaKaRa， 大連)利用ABI Stepone RT-qPCR 系 統(tǒng)(Applied Biosystems， 美 國) 進 行RT-qPCR 反應(yīng)(引物見表1)。PCR 反應(yīng)條件如下： 95°C 30s， 60°C 20s， 72°C 30s， 共40 個擴增循環(huán)； 隨后進行熔解曲線94°C 30s， 72°C 30s， 94°C 30s。采取2-ΔΔCt的方法計算基因的相對表達， 以Pa18S rRNA 作為標準化的內(nèi)參。每組實驗至少重復三次。

1.6 香魚頭腎單核/巨噬細胞培養(yǎng)

收集健康香魚的頭腎， 洗滌和研磨后利用Ficoll (Invitrogen， 上海)密度梯度離心[(1.077±0.001)g/mL]獲得頭腎白細胞富集組分， 按照2×107/mL 的濃度將細胞接種到35mm 培養(yǎng)皿中(Corning， 美國)， 在含5% CO2的培養(yǎng)箱中24°C 過夜培養(yǎng)。去除未貼壁細胞， 貼壁細胞在完全培養(yǎng)基[RPMI 1640 (Invitrogen， 上海)； 5% (V/V) FBS (Gibco， Life Technologies， 美國)； 5% (V/V)香魚血清； 青霉素(100U/mL)和鏈霉素(100μg/mL)]中繼續(xù)培養(yǎng)。HEK293T 細胞在含有10% (V/V) FBS、青霉素和鏈霉素的DMEM (Invitrogen， 上海)的培養(yǎng)基中， 在37°C 含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 瞬時細胞轉(zhuǎn)染

HEK293T 細胞和香魚頭腎 MO/MΦ 按照1×105/mL 的濃度接種到6 孔板(Corning， 美國)中， 細胞融合到 70%—90%后使用 Lipofectamine 3000 (Invitrogen， 上海)轉(zhuǎn)染試劑將真核表達或綠色熒光載體轉(zhuǎn)染進細胞中。

1.8 亞細胞定位

HEK293T 細胞接種在6 孔板中的圓形蓋玻片上。細胞培養(yǎng)12h 后， 轉(zhuǎn)染pEGFP-PaSYK 重組質(zhì)粒。連續(xù)培育36h， 用PBS 洗滌細胞兩次， 并在4% (V/V)多聚甲醛中固定15min。PBS 洗滌兩次， 用Dil (Beyotime， 中國)染細胞膜10min， PBS 洗兩次， DAPI (Sigma， 美國)染核5min。在激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM710 NLO， Carl Zeiss， 美國)下觀察細胞熒光圖像。

1.9 炎癥細胞因子mRNA 表達測定

將pcDNA3.1-PaSYK 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至香魚頭腎MO/MΦ， 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag 空白質(zhì)粒作為對照。分別在24、36 和48hpt (hours post transfection)時收集細胞， RT-qPCR 檢測炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、TGF-β和IL-10 的mRNA 表達。每組實驗至少重復三次。

1.10 Western blot 分析

將pcDNA3.1-PaSYK 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞和香魚頭腎MO/MΦ 中， 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag 空白質(zhì)粒作為對照。在6、12、24 和48hpt 時收集細胞， 加入100μL 蛋白裂解液提取總蛋白， 使用Bradford 法測定蛋白質(zhì)濃度。取15μL 蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳， 并將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上(甲醇活化)； 將PVDF 膜置于含5%脫脂奶粉(W/V)的TBST 中室溫封閉1h， 一抗孵育過夜。TBST 溶液洗膜3 次， 每次15min； 二 抗 采 用 山 羊 抗 兔 IgG-HRP， 室 溫 孵 育1.5h，TBST 溶液洗膜3 次， 每次15min。利用ECL 發(fā)光液進行顯色。用到的一抗為兔抗phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)、兔抗p38 MAPK、兔抗phospho-JNK1/2 (Thr183/Tyr185)、兔抗JNK1/2、兔抗phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)和兔抗P44/42 MAPK (ERK1/2)(Cell Signaling Technology， 上海)。

1.11 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果表示為平均值±標準誤(mean±SEM)， 采用SPSS 13.0 軟件中的單因素方差分析(One-way ANOVA)進行統(tǒng)計， *P＜0.05 和**P＜0.01 被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PaSYK 基因cDNA 序列測定及分析

PaSYK 的ORF 長度為1857bp， 編碼的蛋白質(zhì)含有 618 個氨基酸。該蛋白質(zhì)的分子量(MW)為70.78kDa， 等電點(pI)為8.27。PaSYK 由兩個N 端的SH2 結(jié)構(gòu)域和一個C 末端的激酶結(jié)構(gòu)域組成。多重序列比對結(jié)果表明SYK 的蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)域在進化過程中是高度保守的，PaSYK 與河鱒SYK 氨基酸序列相似度最高(82%)(圖1)。系統(tǒng)進化樹分析顯示， 所有魚類的SYK 歸為一簇， 哺乳類、兩棲類和 爬行類各為一簇，PaSYK 與河鱒的SYK 進化關(guān)系最為密切(圖2)。

圖1 香魚SYK 氨基酸多序列比對 Fig.1 Multiple alignment of PaSYK amino acid sequences

2.2 健康組織及鰻弧菌感染前后PaSYK 基因mRNA的表達分析

在健康香魚的腸、脾、肝、鰓、頭腎和皮膚中均檢測到PaSYK 的mRNA 表達，PaSYK 在皮膚中的表達量最高， 隨后依次為頭腎、鰓、肝、脾、腸(圖3a)。腹腔感染鰻弧菌后， 在所有檢測的組織中PaSYK 的mRNA 表達均以時間依賴性方式顯著上調(diào)。其中， 鰓組織中的PaSYK 表達量在4hpi 時上調(diào)， 24hpi 時表達最高。在脾臟中， 8hpi 時PaSYK 表達上調(diào)， 12hpi 時表達最高， 24hpi 時其表達下降并恢復至正常水平。在頭腎中， 8hpi 時PaSYK 表達上調(diào)， 并隨著感染的持續(xù)表達量逐漸增加。在肝臟中，PaSYK 表達在8hpi 時上調(diào)至最高， 然后逐漸降低至對照值水平。在24hpi 時， 腸中的PaSYK 表達上調(diào)最高(圖3b—f)。

2.3 PaSYK 亞細胞定位分析

HEK293T 細胞轉(zhuǎn)染熒光載體 pEGFP-PaSYK， 激光共聚焦顯微鏡下觀察PaSYK 的亞細胞定位(圖4)。結(jié)果顯示PaSYK 主要分布在細胞質(zhì)中， 少量分布在細胞膜上， 與 DAPI(細胞核指示劑)無共定位信號。

圖2 基于NJ 法構(gòu)建的香魚和其他物種SYK 的系統(tǒng)進化樹 Fig.2 Phylogenetic tree analysis of the SYK protein of ayu and other species using the neighbor-joining method

圖3 健康香魚組織和鰻弧菌感染后免疫組織中PaSYK 表達模式 Fig.3 The expression patterns of PaSYK in healthy ayu tissues and immune tissues after V. anguillarum infection

圖4 PaSYK 亞細胞定位 Fig.4 Subcellular localization of PaSYK

2.4 PaSYK 對炎癥細胞因子mRNA 表達的影響

炎癥是機體受到病原體破壞或入侵時炎癥細胞被激活， 并分泌多種炎癥細胞因子的保護反應(yīng)。促炎因子TNF-α、IL-1β 以及抑炎因子TGF-β、IL-10 是巨噬細胞分泌的重要炎癥因子。研究TNF-α、IL-1β、TGF-β 和IL-10 的mRNA 表達水平， 旨在探討PaSYK對機體炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用。結(jié)果顯示， 在香魚頭腎MO/MΦ 中，PaSYK 過表達后會顯著誘導TNF-α 和IL-1β 的表達， 對抑炎因子的表達沒有起促進作用甚至有略微的抑制(圖5a—d)。

圖5 PaSYK 影響炎癥細胞因子mRNA 表達 Fig.5 The cytokine mRNA expression affected by PaSYK

2.5 PaSYK 活化MAPK 信號通路

我們進一步研究了SYK 活化的信號通路是否在進化過程中具有保守性。MAPK 信號通路是哺乳動物SYK 激活的經(jīng)典信號通路。我們分別在HEK293T 細胞及香魚頭腎MO/MΦ 中轉(zhuǎn)染SYK 以研究三條典型的MAPK 信號通路p38 MAPK、ERK1/2 MAPK 和JNK1/2 MAPK 的活化情況。結(jié)果顯示， 在HEK293T細胞和香魚頭腎MO/MΦ 中過表達PaSYK 后均能檢測到三種MAP 激酶的磷酸化， 代表相應(yīng)的MAPK 信號通路被激活。在HEK293T 細胞中， 12hpt 時p38 的磷酸化水平上升， 在24hpt 時到達最大值， 隨后磷酸化水平降低(圖6a)。ERK1/2 的磷酸化在12hpt 達到最大值， 隨后逐漸降低(圖6b)。JNK1/2 的磷酸化水平也在12hpt 時呈現(xiàn)上升趨勢， 在36hpt 達到最大值后降低(圖6c)。香魚頭腎MO/MΦ 在靜息狀態(tài)下能觀察到JNK1/2 磷酸化， 但在一個相對較低的水平(圖6f)。過表達PaSYK 后， p38 和ERK1/2 的磷酸化在12hpt 時升高， 24hpt 達到最大值， 隨后逐漸降低(圖6d—e)。JNK1/2 的磷酸化也在12hpt 時顯著升高， 24hpt 達到最大值， 隨后維持相似的活化程度(圖6f)。

3 討論

脾臟酪氨酸激酶SYK 在免疫信號轉(zhuǎn)導中起著關(guān)鍵的作用。本研究從分子、蛋白質(zhì)和細胞水平對香魚SYK 進行了分析， 結(jié)果表明香魚SYK 參與了鰻弧菌感染的免疫反應(yīng)， 并能誘導炎癥細胞因子的表達和激活MAPK 信號通路。

本研究通過香魚頭腎MO/MΦ 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果獲得SYK 基因的cDNA 序列。多重序列比對分析表明，PaSYK 具有典型的SYK 結(jié)構(gòu)特征，PaSYK 包含兩個N 端的SH2 結(jié)構(gòu)域和一個C端的激酶結(jié)構(gòu)域， 這與以往關(guān)于人(Lawet al， 1994)、七鰓鰻(Liuet al， 2015)、石斑魚(Moet al， 2016)、尼羅羅非魚(Bianet al， 2018)等其他物種的報道一致。系統(tǒng)進化樹分析表明， 哺乳動物、鳥類、兩棲類和魚類的SYK 分別成簇，PaSYK 位于魚類SYK 這一個大簇， 且與河鱒SYK 進化關(guān)系最近。

SYK 基因最開始是由Taniguchi 等(1991)從豬脾cDNA 中克隆出來。SYK 在人類的造血細胞中的表達量最高(Yanagiet al， 2001)。最初認為SYK 只在造血細胞中表達， 后來研究發(fā)現(xiàn)SYK 在乳腺上皮細胞(Coopmanet al， 2000)、氣道上皮細胞(Wanget al， 2005)、鼻成纖維細胞(Yamadaet al， 2001)、血管內(nèi)皮細胞(Crowleyet al， 1997)、神經(jīng)樣細胞(Tsujimuraet al， 2001)、肝細胞(Tsuchidaet al， 2000)及黑色素細胞(Hoelleret al， 2005)等非造血細胞中也有廣泛表達。 在七鰓鰻中， SYK 在神經(jīng)上髓樣體和白細胞中表達最高(Liuet al， 2015)。在石斑魚中， SYK 的mRNA 表達廣泛， 其中在肝臟和免疫器官(包括脾臟和腎臟)中高表達(Moet al， 2016)， 尼羅羅非魚與其結(jié)果相似(Bianet al， 2018)。本研究中，PaSYK 的mRNA 在皮膚中的表達量最高， 隨后依次為頭腎、鰓、肝、脾、腸。此外， 鰻弧菌感染后鰓、脾、頭腎、肝和腸免疫組織PaSYK 基因mRNA 表達量均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。

圖6 PaSYK 激活MAPK 信號 Fig.6 Activation of MAPK signaling by PaSYK

炎癥是一種病理過程， 病原體作用于機體后， 不僅會引發(fā)細胞的損壞， 也會使系統(tǒng)抗病能力提高， 從而到達清除病原體， 修復受損細胞的作用。在炎癥反應(yīng)中， 細胞能產(chǎn)生炎癥細胞因子來抵抗外界的侵襲， TNF-α、IL-1β、TGF-β 和IL-10 是巨噬細胞分泌的重要炎癥因子。本研究結(jié)果表明， 將SYK 基因轉(zhuǎn)染到香魚MO/MΦ 中， 促炎因子TNF-α 和IL-1β 的mRNA表達顯著上調(diào)， 而抑炎因子TGF-β 和IL-10 的mRNA表達卻受到略微的抑制。PaSYK 能夠顯著誘導促炎因子TNF-α 和IL-1β 的表達， 說明機體受到病原體入侵時， SYK 能夠參與香魚頭腎MO/MΦ 的炎癥反應(yīng)。

細胞對外界變化做出的反應(yīng)是通過一連串胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導來傳導的， 信號通路整合各種信號， 通過基因和生理的改變來應(yīng)對外界刺激。MAPK 被激活后會參與細胞增殖、分化及凋亡的調(diào)節(jié)， 并與炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)(Takadaet al， 2004)。Ras作為一種GTP 酶， 是MAPK 磷酸化級聯(lián)反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)分子。Ras-Raf-MAPK 信號級聯(lián)是人和哺乳動物細胞中主要的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)。有研究表明， 肥大細胞的FcεRI 受體與抗原結(jié)合后， 依賴SYK 銜接蛋白Shc磷酸化， 從而激活Ras-Raf-MAPK 級聯(lián)(Jabril-Cuenodet al， 1996)。為了探究香魚SYK 是否也能像哺乳動物那樣激活MAPK 信號通路， 本研究將SYK 轉(zhuǎn)染到HEK293T 細胞和香魚頭腎MO/MΦ 中， Western blot的結(jié)果表示，PaSYK 過度表達后三種傳統(tǒng)的MAP 激酶均被激活， 說明PaSYK 可以激活MAPK 信號， 其在進化過程中高度保守。

4 結(jié)論

本研究從香魚中克隆得到SYK 基因， 通過蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)， 在SYK 存在典型的兩個連接的SH2結(jié)構(gòu)域和一個激酶結(jié)構(gòu)域。通過表達分析發(fā)現(xiàn)，PaSYK 的表達會受到鰻弧菌感染的影響。亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，PaSYK 分布于細胞質(zhì)中， 細胞膜上也有少量的分布。RT-qPCR 結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，PaSYK 的過表達會促進促炎因子的表達并且抑制抑炎因子的表達。Western blot 結(jié)果證明，PaSYK 與其哺乳動物中的同源物一樣， 能夠活化MAPK 信號通路， 說明了其在進化過程中， 結(jié)構(gòu)及功能的保守性。