董甜甜 崔彥婷 王忠凱 龍勁男 陳怡更 王 聰 趙楠楠 王仁杰 李玉全

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院 青島 266109)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)俗稱南美白對(duì)蝦， 原產(chǎn)于拉丁美洲的熱帶太平洋海岸， 具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)， 且耐鹽性非常廣， 可耐受鹽度范圍為2—78(張偉權(quán)， 1990)， 是目前世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大優(yōu)良蝦種之一， 也是中國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖的主要種類(欒生等， 2013； 黃永春等， 2013)。但是隨著養(yǎng)殖規(guī)模、地域的擴(kuò)大， 凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖出現(xiàn)環(huán)境惡化、生長(zhǎng)速率減慢和病害頻發(fā)等問(wèn)題(馮東岳等， 2011； Reverteret al， 2014)。研究者們努力探尋對(duì)蝦養(yǎng)殖的新環(huán)境和新模式。在山東、河北及天津等沿海， 以及西北地區(qū)存在大面積高鹽水域， 可在這些高鹽水域進(jìn)行凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖， 并且高鹽水體養(yǎng)殖的對(duì)蝦口感、品質(zhì)都優(yōu)于低鹽水體， 更受消費(fèi)者的喜愛(ài)， 具有很好的發(fā)展前景。因此， 高鹽水體對(duì)蝦養(yǎng)殖也引起許多學(xué)者的關(guān)注與研究(李娜等， 2018； 趙玉超等， 2019)。

鹽度是直接影響蝦類生長(zhǎng)、代謝和抗氧化等的重要環(huán)境因子。李二超(2008)研究發(fā)現(xiàn)， 鹽度能夠顯著影響凡納濱對(duì)蝦的增長(zhǎng)率與成活率； 李婷等(2011)報(bào)道， 凡納濱對(duì)蝦在適宜鹽度范圍內(nèi)， 隨著鹽度的上升， 能量消耗減少， 攝入能量的利用率提高； 李華等(2007)研究表明， 凡納濱對(duì)蝦在低鹽(鹽度4)環(huán)境中SOD活力高于高鹽(鹽度32)環(huán)境。通常情況下， 可以通過(guò)測(cè)定甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、ATP的含量和蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)活力等代謝指標(biāo)， 超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶活力來(lái)了解內(nèi)外因子對(duì)甲殼動(dòng)物的影響(張艷等， 2005； 劉群芳等， 2013； 龍曉文等， 2019)。目前， 關(guān)于鹽度對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、代謝和抗氧化方面的研究主要集中在低鹽度(王妤等， 2011； Gaoet al， 2016)， 高鹽度方面的研究報(bào)道較少， 鑒于此， 本實(shí)驗(yàn)擬以凡納濱對(duì)蝦為實(shí)驗(yàn)材料， 分析高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)指標(biāo)、代謝物質(zhì)含量及代謝、抗氧化相關(guān)酶活力的影響， 以豐富對(duì)蝦生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)， 同時(shí)為高鹽水域凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用凡納濱對(duì)蝦購(gòu)自山東省海陽(yáng)市某養(yǎng)殖場(chǎng)， 運(yùn)至青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室后， 暫養(yǎng)于PVC 水桶(300L)中。暫養(yǎng)期間所用海水鹽度34， pH 8.0±0.5， 用加熱棒將溫度控制在(28±0.5)°C， 每天投喂四次(7：00， 12：00， 17：00， 22：00)， 每日換水1 次， 每次換水50%， 24h 充氣泵充氧。暫養(yǎng)7d 后， 每天以2 個(gè)鹽度的速度由34 逐漸馴化至實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)鹽度梯度。高鹽度海水由天然海水(鹽度23 左右)與海水素(濰坊海之絢水族用品科技有限公司)調(diào)配而成。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)對(duì)蝦初始體長(zhǎng)(7.6±0.2)cm， 體重(3.0±0.4)g。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置25、35、45、55四個(gè)鹽度梯度， 其中鹽度25作為對(duì)照組， 每個(gè)鹽度組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行放入大小均勻、健康的凡納濱對(duì)蝦30尾。每天投喂四次， 投喂等日常管理同暫養(yǎng)。每天上午10：00換水1次， 換水量為50%。實(shí)驗(yàn)為期30d， 每隔10d測(cè)定1次體長(zhǎng)和體重， 每個(gè)平行取3尾對(duì)蝦取血淋巴和肝胰腺。

1.3 樣品收集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前24h 停止投喂。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)， 每個(gè)平行中隨機(jī)取3 尾對(duì)蝦， 用一次性注射器(l.0mL)從對(duì)蝦心臟抽取血淋巴1︰1 加入抗凝劑混合， 放入1.5mL的Eppendorf 管中， 4°C 過(guò)夜后4000r/min 離心15min， 取上清液(血清)置于-80°C 冰箱保存?zhèn)溆?。取其肝胰臟裝入Eppendorf 管中， 迅速投入液氮冷凍， 再轉(zhuǎn)移到-80°C 冰箱保存， 以上操作均在冰盤(pán)中進(jìn)行。組織樣品先用剪刀剪碎， 準(zhǔn)確稱重后置于勻漿管中， 加入9 倍體積的生理鹽水， 勻漿機(jī)勻漿后冷凍離心機(jī)3000r/min 離心10min， 分別稀釋至所需濃度后進(jìn)行ATP 含量的測(cè)定。

1.4 指標(biāo)測(cè)定及數(shù)據(jù)處理

式中，W0為初始平均體重(g)，Wt為終末平均體重(g)，L0為初始平均體長(zhǎng)(cm)，Lt為終末平均體長(zhǎng)(cm)，t為實(shí)驗(yàn)時(shí)間(d)。Nsr為存活的個(gè)體數(shù)目，N0為起始放入的總個(gè)體數(shù)。

甘油三酯、膽固醇、ATP 的含量和蘋(píng)果酸脫氫酶、總超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活力測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定， 樣品前處理、試劑配制和測(cè)定步驟嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

所得數(shù)據(jù)用 SPSS22.0 軟件進(jìn)行單因子方差(ANOVA)及 Duncan 多重比較進(jìn)行分析處理， 以P＜0.05 作為差異顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 高鹽脅迫對(duì)生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)指標(biāo)的影響見(jiàn)表1。從表1 可以看出， 隨著鹽度的升高， 凡納濱對(duì)蝦的增重率與特定生長(zhǎng)率均逐漸降低， 鹽度25 時(shí)增重率與特定生長(zhǎng)率最高， 鹽度35 和鹽度45 時(shí)次之， 鹽度55時(shí)最低， 且各處理組較對(duì)照組降低顯著(P＜0.05)； 凡納濱對(duì)蝦的增長(zhǎng)率也隨著鹽度的升高逐漸降低， 且45 鹽度組和55 鹽度組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)， 但35 鹽度組與對(duì)照組間差異不顯著(P＞0.05)； 成活率呈逐漸降低的趨勢(shì)， 在鹽度25 時(shí)最高， 為65.67%， 鹽度55 時(shí)最低， 為43%， 且55 鹽度組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)， 其他組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 高鹽脅迫對(duì)脂類代謝物質(zhì)含量的影響

2.2.1 TG 含量 高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦TG 含量的影響見(jiàn)圖1。從圖1 可以看出， 隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加， 各處理組TG 含量整體上呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)， 10d 時(shí)TG 含量隨著鹽度的增加逐漸降低， 55 鹽度組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。20d 和30d 時(shí)各鹽度組TG 的含量逐漸升高， 55 鹽度組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

表1 高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的影響 Tab.1 Effect of high-salinity stress on growth of L. vannamei

圖1 高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦TG 含量的影響 Fig.1 Effect of high-salinity stress on TG content in L. vannamei

2.2.2 TC 含量 高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦TC 含量的影響見(jiàn)圖2。從圖2 可以看出， 10d 時(shí)TC 含量隨著鹽度的增加總體上逐漸升高， 20d 和30d 時(shí)35 鹽度組、45 鹽度組較對(duì)照組下降， 且除對(duì)照組外其余各組隨鹽度升高呈上升趨勢(shì)。55 鹽度組TC 含量相較于其他組最高，且30d 時(shí)顯著高于其他組(P＜0.05)。

圖2 高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦TC 含量的影響 Fig.2 Effect of high-salinity stress on TC content in L. vannamei

2.3 高鹽脅迫對(duì)MDH 活力的影響

高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦MDH 活力的影響見(jiàn)圖3。從圖3 可以看出， 10d 時(shí)MDH 活力隨著鹽度的增加逐漸降低， 45 鹽度組和 55 鹽度組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加， 各處理組MDH 活力逐漸高于對(duì)照組， 呈現(xiàn)隨鹽度升高活力增加的趨勢(shì)， 在20d、30d 時(shí)活力較高， 且45 鹽度組和55 鹽度組顯著高于其他組(P＜0.05)， 其余各處理組之間均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

圖3 高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦MDH 活力的影響 Fig.3 Effect of high-salinity stress on MDH activity of L. vannamei

2.4 高鹽脅迫對(duì)ATP 含量的影響

高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦ATP 含量的影響見(jiàn)圖4。由圖4 可以看出， 0d、10d 和20d 時(shí)各處理組ATP 含量總體升高， 隨鹽度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)， 鹽度45 時(shí)出現(xiàn)最大值， 且35 鹽度組、45 鹽度組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。30d 時(shí)各處理組ATP 含量較對(duì)照組下降， 55 鹽度組下降顯著(P＜0.05)。

2.5 高鹽脅迫對(duì)抗氧化酶活力的影響

圖4 高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦ATP 含量的影響 Fig.4 Effect of high-salinity stress on ATP content in L. vannamei

圖5 高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦T-SOD 活力的影響 Fig.5 Effect of high-salinity stress on T-SOD activity of L. vannamei

2.5.1 T-SOD 活力 高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦T-SOD 活力的影響見(jiàn)圖5。從圖5 可以看出， 0d 和10d 時(shí)55 鹽度組T-SOD 活力與其他組差異顯著(P＜0.05)， 其他各時(shí)間點(diǎn)各處理組間差異均不顯著(P＞0.05)， 但隨著時(shí)間的增加， 呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)， 30d 時(shí)出現(xiàn)最大值。 2.5.2 CAT 活力 高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦CAT活力的影響見(jiàn)圖6。由圖6 可以看出， 隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加， 各處理組CAT 活力總體呈先上升后下降再上升趨勢(shì)， 30d 時(shí)出現(xiàn)最大值。20d 和30d 時(shí)CAT 活力整體高于對(duì)照組， 但差異并不顯著(P＞0.05)。

圖6 高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦CAT 活力的影響 Fig.6 Effect of high-salinity stress on CAT activity of L. vannamei

3 討論

3.1 高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

鹽度是影響甲殼類動(dòng)物生長(zhǎng)和存活的重要環(huán)境因子。大多數(shù)甲殼動(dòng)物都有一定的鹽度耐受范圍， 在適宜的鹽度范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好， 但當(dāng)鹽度超出可承受范圍時(shí)， 機(jī)體會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激， 嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致死亡。李二超等(2009)研究表明， 當(dāng)水體鹽度高于或低于自身滲透壓時(shí)， 甲殼類動(dòng)物為了調(diào)節(jié)自身滲透壓平衡會(huì)消耗更多的能量， 從而使用于生長(zhǎng)發(fā)育的能量減少， 生長(zhǎng)受到抑制。凡納濱對(duì)蝦屬于廣鹽生物， 朱春華(2002)研究發(fā)現(xiàn)， 凡納濱對(duì)蝦的等滲點(diǎn)在14—22鹽度范圍內(nèi)， 此范圍內(nèi)用于滲透壓調(diào)節(jié)的耗能較少， 當(dāng)鹽度超出這個(gè)范圍時(shí)， 體內(nèi)外會(huì)形成較大的滲透壓梯度差， 對(duì)蝦為了維持自身滲透平衡會(huì)消耗更多的能量， 從而影響對(duì)蝦生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中， 隨著鹽度的增加， 凡納濱對(duì)蝦的增重率、增長(zhǎng)率與特定生長(zhǎng)率均顯著降低， 說(shuō)明在遠(yuǎn)離對(duì)蝦等滲點(diǎn)時(shí)， 對(duì)蝦需要更多的能量以維持機(jī)體滲透平衡， 導(dǎo)致生長(zhǎng)減慢。這與李二超等(2009)和朱春華(2002)的研究結(jié)果一致； 凡納濱對(duì)蝦的成活率隨鹽度的變化表現(xiàn)為25 ＞ 35 ＞ 45 ＞ 55， 說(shuō)明過(guò)高的鹽度會(huì)影響對(duì)蝦的存活。這與李娜等(2017)、沈敏等(2019)的研究結(jié)果一致。

3.2 高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦脂類代謝物質(zhì)含量的影響

動(dòng)物體的代謝包括三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝， 脂類代謝是其中重要的一種。血漿甘油三酯和膽固醇是血脂的重要組成成分， 能夠給機(jī)體提供能量， 合成某些酶、維生素和激素等， 是維持正常生命活動(dòng)所必需的物質(zhì)(Likimaniet al， 1982)。因此， 甘油三酯和膽固醇含量的變化在一定程度上能夠反映脂類代謝的情況。當(dāng)外界環(huán)境改變時(shí)， 機(jī)體為克服脅迫會(huì)動(dòng)用脂類提供能量。甘油三酯能夠分解成甘油和脂肪酸， 這一過(guò)程伴隨著能量的釋放(Racottaet al， 1998)。賈小燕等(2012)研究發(fā)現(xiàn)， 中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)由淡水進(jìn)入鹽度12的水體6h后， TG含量顯著下降， 表明TG消耗增多， 說(shuō)明此階段脂類作為能源物質(zhì)的比例加大， 機(jī)體加速動(dòng)用脂類以分解供能。本實(shí)驗(yàn)中， 10d時(shí)各鹽度組TG的含量隨著鹽度的增加逐漸降低， 表明對(duì)蝦體內(nèi)TG消耗量增多， 說(shuō)明在這一階段對(duì)蝦分解脂類提供能量， 且鹽度越高， 對(duì)蝦用以調(diào)節(jié)滲透壓平衡所需的能量越高， 所以TG含量消耗越多。20d和30d時(shí)甘油三酯的含量逐漸升高， 推測(cè)可能是隨著時(shí)間的增加， 脂類代謝不再是主要的供能來(lái)源， 蛋白質(zhì)代謝或糖類代謝開(kāi)始發(fā)揮作用， 或者是脂類的合成增加， 從而使TG含量累積， 具體原因有待進(jìn)一步研究。膽固醇是甲殼動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中重要的激素前體和細(xì)胞膜組成物質(zhì)， 對(duì)甲殼動(dòng)物性腺發(fā)育、蛻皮及代謝等具有重要的調(diào)節(jié)作用(Sheen， 2000； Gonget al， 2004； 田志環(huán)等， 2013)。本實(shí)驗(yàn)中， 55鹽度組的TC含量相較于其他組最高， 可能是由于血液膽固醇水平與機(jī)體免疫代謝密切相關(guān)， 高鹽度脅迫下凡納濱對(duì)蝦生理狀況不佳， 對(duì)蝦通過(guò)提高膽固醇代謝水平從而維持自身的生理健康(龍曉文等， 2013)。

3.3 高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦MDH 活力的影響

三羧酸循環(huán)(TAC)又稱檸檬酸循環(huán)， 是動(dòng)物體糖類代謝過(guò)程中重要的一環(huán)， 它參與糖的有氧氧化之后的代謝過(guò)程， 能夠?qū)⒈嵘傻拇x底物乙酰輔酶A 進(jìn)一步氧化為水和二氧化碳。蘋(píng)果酸脫氫酶是TAC 的關(guān)鍵酶之一， 其主要作用是可以催化蘋(píng)果酸和草酰乙酸(可與乙酰輔酶A 生成檸檬酸)之間的可逆轉(zhuǎn)換， 這一過(guò)程伴隨著能量的生成(汪新穎等， 2009)。它也是調(diào)節(jié)糖代謝效率的關(guān)鍵酶之一， 其活力能夠在一定程度上反映出糖代謝水平的高低。本實(shí)驗(yàn)中， 45 鹽度組和55 鹽度組MDH 活力在10d 時(shí)顯著低于對(duì)照組， 可能是在這一時(shí)間糖代謝不是主要功能途徑， TAC 功能受到抑制。20d、30d 時(shí)， 45 鹽度組和55 鹽度組的MDH 活力顯著高于對(duì)照組， 且鹽度越高， 活力越強(qiáng)， 說(shuō)明隨著鹽度的增加， 對(duì)蝦用于維持正常生理需求所需的能量增加， 從而使TAC 作用加強(qiáng)。這與房子恒等(2016)在半滑舌鰨上的研究結(jié)果相一致。

3.4 高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦ATP 含量的影響

三磷酸腺苷(adenosine triphosphate， ATP)作為生物體能量的直接供應(yīng)者， 是生物活性的主要標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)中， 10d、20d時(shí)35鹽度組、45鹽度組顯著高于對(duì)照組， 說(shuō)明高鹽脅迫下凡納濱對(duì)蝦需要更多的能量供給， 繼而水解釋放出大量的ATP， ATP含量升高(Shenet al， 2020)。30d時(shí)各處理組ATP含量下降， 推測(cè)可能是在此時(shí)間段對(duì)蝦已經(jīng)逐漸適應(yīng)鹽度脅迫， 也可能是前20d對(duì)蝦的代謝以有氧代謝為主， ATP釋放量大， 而30d時(shí)無(wú)氧代謝發(fā)揮主要作用(施兆鴻等， 2015)， 具體原因還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.5 高鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗氧化酶活力的影響

當(dāng)環(huán)境因子發(fā)生變化時(shí)， 水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體會(huì)受到氧化脅迫而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)(Tomaneket al， 2011)， 與此同時(shí)機(jī)體的抗氧化酶活力也會(huì)發(fā)生改變。超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)是重要的抗氧化酶。它們廣泛存在于需氧和耐氧生物體內(nèi)(楊細(xì)蘭， 2011)。SOD是抗氧化反應(yīng)的第一道防御屏障， 其作用機(jī)理是通過(guò)2O2-+2H+→H2O2+O2反應(yīng)達(dá)到清除體內(nèi)過(guò)量氧自由基的目的， 在平衡氧化與抗氧化過(guò)程中有至關(guān)重要的作用(徐靖， 2013)。CAT是抗氧化酵素系統(tǒng)的重要一員， 也是過(guò)氧化物酶體的標(biāo)志酶， 它可以加速過(guò)氧化氫的分解， 阻止氫氧自由基有毒物質(zhì)的產(chǎn)生， 對(duì)保護(hù)抗氧化系統(tǒng)的功能和動(dòng)物體的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝活動(dòng)具有重要意義。CAT可將超氧化物歧化酶的作用產(chǎn)物進(jìn)一步還原， 兩者相互作用從而保護(hù)機(jī)體不受活性氧自由基的傷害(Fridovich， 1995； 張克烽等， 2007)。本實(shí)驗(yàn)中， 在高鹽脅迫下， T-SOD活力與CAT活力都發(fā)生不同程度的變化， 且隨著時(shí)間的增加各處理組的酶活力總體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)， 說(shuō)明高鹽脅迫能夠激活凡納濱對(duì)蝦的抗氧化能力， 且隨著時(shí)間的增加有適應(yīng)性的變化。在20d和30d時(shí)， 各處理組T-SOD活力與CAT活力整體高于對(duì)照組， 推測(cè)可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期的高鹽脅迫導(dǎo)致對(duì)蝦體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基， 機(jī)體為了保護(hù)體內(nèi)細(xì)胞不受傷害從而誘導(dǎo)SOD、CAT活力升高以清除這些活性氧自由基(王曉杰等， 2005； 王蕓等， 2018)。

4 結(jié)論

綜上所述， 高鹽脅迫會(huì)影響凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)與存活， 鹽度越高， 生長(zhǎng)越慢， 存活率越低； 會(huì)使T-SOD 和CAT 的活力升高， 激發(fā)凡納濱對(duì)蝦的抗氧化系統(tǒng)。高鹽水體中， 滲透壓調(diào)節(jié)需要更多能量， 凡納濱對(duì)蝦會(huì)通過(guò)脂類代謝和糖類代謝等釋放能量， 維持自身的生理需求。本實(shí)驗(yàn)只分析了脂類代謝和糖代謝中的三羧酸循環(huán)過(guò)程， 并不能完全了解高鹽條件下對(duì)蝦的生理變化， 還需要從蛋白質(zhì)代謝以及其它糖類代謝過(guò)程等方面做進(jìn)一步的研究。