段必成 張 薪 葉 勤 何 春 鄧華堂 陳轍聿 李 云①

(1. 西南大學水產(chǎn)學院 重慶三峽生態(tài)漁業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 重慶 400715； 2. 中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中上游漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站 武漢 430233； 3. 西南大學化學化工學院 重慶 400715)

人工增殖放流是水生生物資源養(yǎng)護的重要措施， 對放流效果的評價及漁業(yè)資源的管理和評估工作需要對放流魚類進行標記， 目前較多使用的掛牌、剪鰭等標記方法存在保留時間短、成本高、操作損傷、標記量小等問題(王茂元等， 2015)。熒光染料標記方法減少了操作損傷， 適用于大規(guī)模標記放流。熒光物質(zhì)標記方法的原理主要是通過用與鈣具有親和性的熒光化合物如鹽酸四環(huán)素、鈣黃綠素、茜素紅等使其沉積于魚類的鈣化組織——耳石上以形成在熒光顯微鏡下可識別的化學標記(Nielsen， 1992)。鹽酸四環(huán)素(Tetracycline Hydrochloride， TCH)作為熒光標記染料已經(jīng)使用了近50 年(Weberet al， 1962)， 對太平洋鮭 魚(Oncorhynchusspp.)、美洲西鯡(Alosa sapidissima)、白鮭(Coregounssp.) 、許氏平 鲉(Sebastes schlegelii)、斑馬魚(Danio rerio)等魚類耳石的標記效果明顯， 熒光標記可維持約 5—24 個月， 最長可保持 3 年半(Weberet al， 1967； Lorsonet al， 1987； Yamadaet al， 1987； Nagi??et al， 1988； Lüet al， 2014a； 郭鶴等， 2019)。在標記放流過程中， 被標記魚體所受的脅迫、損傷是影響成活率的關(guān)鍵， 熒光標記是否對標記魚類機體產(chǎn)生脅迫、損傷及魚類生理響應(yīng)等方面需要加強研究。

鰱(Hypophthalmichthys molitrix)是我國主要養(yǎng)殖魚類， 也是內(nèi)陸河流、湖泊、水庫主要增殖放流和漁業(yè)捕撈種類(李思發(fā)等， 1990； 謝平， 2003； 張永正等， 2018)， 人工增殖放流已經(jīng)成為補充和恢復(fù)其天然資源的重要途徑(陳文靜， 2013； 張永正等， 2018)， 對其增殖放流效果的評估對有效了解其資源狀況尤為重要。 然而， 關(guān)于鰱的標記方法及效果報道較少(李小芳等， 2012； 王茂元等， 2015)。為建立一種有效的TCH 熒光標記鰱耳石的方法， 了解TCH 標記對鰱肝臟的應(yīng)激脅迫影響， 本研究首先用顯微鏡檢的方法對TCH 浸泡與藥餌投喂兩種熒光標記耳石的方法進行效果比較， 之后用其中一種效果較好的標記方法處理實驗魚， 運用生理生化方法對標記后鰱的肝臟轉(zhuǎn)氨酶和氧化應(yīng)激指標進行檢測， 了解TCH 標記對鰱肝臟功能的影響情況， 研究結(jié)果可為TCH 標記鰱的可行性及安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

鰱魚種購于重慶市北碚區(qū)歇馬魚場。體長為17.5—20.0cm， 體重為80.0—100.0g， 該規(guī)格為三峽庫區(qū)鰱增殖放流常用規(guī)格大小。實驗魚缸規(guī)格為220L(養(yǎng)殖水體100L)， 調(diào)節(jié)室溫在24—28°C， 曝氣2d 的自來水， pH 為7.5 左右， 光周期為10h：14h。購回后在恒溫室內(nèi)暫養(yǎng)7d， 期間按時按量投喂花白鰱粉料， 早晚各一次。之后挑選體質(zhì)健康魚種作為實驗對象， 在進行正式實驗前停食24h， 為防止餌料對實驗的影響， 24h浸泡實驗期間不投喂。

1.2 藥餌投喂熒光標記方法及樣品處理

先將TCH(上海生工生物工程公司， 分析純粉劑)按比例稱取與花白鰱粉料混合， 將明膠溶液倒入飼料中攪拌混勻， 再鋪開晾干制成粉狀藥餌飼料。根據(jù)預(yù)試驗， 設(shè)置1 個對照組和3 個實驗組， 實驗組TCH 含量依次為4%、8%、12%， 各組均設(shè)3 個平行重復(fù)組， 每組隨機分20 尾魚， 投喂養(yǎng)殖密度為2 尾/10L， 投喂周期為3d， 每天投喂2 次。投喂結(jié)束后進行常規(guī)飼養(yǎng)， 每天定時投喂兩次， 換水一次， 每次換水三分之一。

在藥餌投喂處理后于第10、22d 進行取樣， 每次均在每個重復(fù)組隨機選取3 尾魚， 每個投喂組共取9尾魚， 根據(jù)本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)TCH 標記微耳石效果更好(郭鶴等， 2019)， 解剖取出不同TCH 含量下的鰱微耳石(lapillus)， 清洗后用配有數(shù)碼照相機(Leica DFC 495)的倒置熒光顯微鏡(Leica DMIL LED)5 倍物鏡下觀察熒光標記并拍照， 標記質(zhì)量判斷參照歐陽斌等(1999)的方法。

1.3 熒光浸泡標記方法及樣品處理

先將TCH(上海生工生物工程公司， 分析純粉劑)溶于蒸餾水中， 配制成2g/L 的母液， 然后用母液加曝氣的自來水稀釋配制成不同濃度的浸泡液。根據(jù)預(yù)實驗， 設(shè)置1 個對照組和3 個實驗組， 實驗組TCH濃度依次為150、250、350mg/L， 所有組均設(shè)3 個平行重復(fù)組， 每組隨機分20 尾魚， 浸泡密度為2 尾/10L， 浸泡時間為24h。浸泡結(jié)束后將魚轉(zhuǎn)移至正常水體中飼養(yǎng)， 每天定時投喂兩次， 換水一次， 每次換水三分之一。浸泡處理后第1、2、5、10、22d， 每次均在每個平行重復(fù)組隨機選取3 尾魚， 每個濃度組共取9尾魚， 用濃度為0.2g/L 的MS-222 快速麻醉， 尾靜脈采血， 然后在冰盤上剝離出肝臟用液氮速凍并稱重， -80°C 保存待測。抽取的血樣在4°C 靜置2—4h 后， 用冷凍離心機(4°C)以3000r/min 離心10min， 吸取上清液待測。同時在浸泡處理后于第10、22d 分別解剖取出不同濃度下的鰱微耳石(lapillus)， 顯微鏡檢方法同1.2。

1.4 浸泡熒光標記生化指標測定

將離心所得血清分別取500μL 裝于5mL 離心管中， 用試劑盒測定血清生化指標谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性(四川省新成生物科技有限責任公司)。取出凍存的肝臟， 按照質(zhì)量體積比1：9 加入生理鹽水， 置于冰上充分勻漿后， 用冷凍離心機(4°C)以3000r/min 離心10min， 取上清液， 用試劑盒測定肝臟超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT) 活性和丙二醛(MDA)、總蛋白(TP)含量(南京建成生物工程有限公司)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS18.0 進行統(tǒng)計分析， 采用單因素方差分析法(One-Way ANOVA)進行分析， 最小極差法(LSD)比較組間差異， Microcal Origin6.0 作圖處理， 實驗結(jié)果用平均值±標準偏差(Mean±SD)表示，P＜0.05 時表示有顯著性差異，P＜0.01 時表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 TCH 藥餌投喂熒光標記效果

TCH 藥餌投喂處理3d， 4%、8%、12%含量的鰱魚種在投喂過程中及投喂后22d， 均無死亡個體， 攝食及活動能力與對照組無明顯區(qū)別。在藍色激發(fā)光I3下觀察投喂結(jié)束后第10、22d 的鰱微耳石， 標記率為100%。但是同一觀測時間點， 隨著藥餌TCH 含量升高， 微耳石上的熒光強度變化不規(guī)律， 標記效果不穩(wěn)定(圖1)。

圖1 不同含量TCH 藥餌投喂3d 微耳石(lapillus)熒光照片(放大5 倍) Fig.1 The fluorescent photographs of lapillus with different dosed TCH diets feeding for 3d (5 times)

2.2 TCH 浸泡熒光標記效果

TCH 溶液浸泡處理24h， 150、250、350mg/L 濃度中的鰱魚種在浸泡過程中及浸泡后22d， 均無死亡個體， 攝食及活動能力與對照組無明顯區(qū)別。在藍色激發(fā)光I3下觀察浸泡結(jié)束后第10d、22d 的鰱微耳石， 標記率100%。同一時間下， TCH 浸泡液濃度越高， 微耳石上的熒光標記強度越高， 標記效果越好， 350mg/L 組標記效果最明顯(圖2)。

圖2 不同濃度TCH 浸泡24h 微耳石(lapillus)熒光照片(放大5 倍) Fig.2 The fluorescent photograph of lapillus with different-concentration TCH immersion for 24h (5 times)

2.3 TCH 浸泡標記鰱血清轉(zhuǎn)氨酶活性變化

2.3.1 血清ALT 酶活性的變化 TCH 浸泡處理后的第1d， 各濃度組ALT 活性與對照組[(23.43±3.69)U/L]相比分別極顯著升高至(32.15±1.96)、(32.71±5.92)和(41.75±4.50)U/L (P＜0.01)。第2d 150mg/L 濃度組ALT活性下降至對照組水平[(23.39±2.74)U/L]， 250mg/L和350mg/L 濃度組ALT 活性仍有極顯著升高， 第5d之后雖有波動， 但均與對照組無顯著差異， 直至處理后第22d(圖3)。

圖3 TCH 24h 浸泡處理對鰱血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性的影響(n=9) Fig.3 Effect of TCH 24h immersion on serum alanine aminotransferase (ALT) activity in silver carp (n=9)

2.3.2 血清AST 活性的變化 TCH 浸泡處理后第1d， 250mg/L 和350mg/L 濃度組AST 活性與對照組[(83.00±5.11)U/L]相比極顯著升高至(97.98±3.59)U/L和(115.08±3.72)U/L (P＜0.01)， 150mg/L 濃度組出現(xiàn)略微降低， 但差異不顯著， AST 與ALT 同為反映肝功能狀況的指標， 其變化趨勢與ALT 基本一致。處理后第2d 除250mg/L 濃度組外， 其他組AST 活性出現(xiàn)下降， 在第5d 降至與對照組水平[(85.88±6.09)U/L]無顯著差異(圖4)。

圖4 TCH 24h 浸泡處理對鰱血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性的影響(n=9) Fig.4 Effect of TCH 24h immersion on serum aspartate aminotransferase (AST) activity in silver carp (n=9)

2.4 肝臟MDA 含量和抗氧化酶活性變化

2.4.1 肝臟MDA 含量的變化 TCH 浸泡后第1d， 各濃度組與對照組氧化損傷指標 MDA 含量[(276.78±29.23)nmol/mg prot]相比分別極顯著升高至(438.11±61.15)、(472.25±27.98)和(548.51±18.97)nmol/mg prot (P＜0.01)， 但在第2d MDA 含量即開始出現(xiàn)大幅度下降， 均極顯著低于(279.27±18.79)nmol/mg prot 的對照組含量(P＜0.01)， 從第2d 到第10d， 期間除10d時 150mg/L 濃度組 MDA 最先恢復(fù)到與對照組(209.44±26.74)nmol/mg prot 無顯著差異外， 到第22d各濃度組均恢復(fù)到與對照組[(240.33±13.82)nmol/mg prot]無顯著差異(圖5)。

圖5 TCH 24h 浸泡處理對鰱肝臟丙二醛(MDA)含量的影響(n=9) Fig.5 Effect of TCH 24h immersion on liver malondialdehyde (MDA) content in silver carp (n=9)

2.4.2 肝臟SOD 活性的變化 TCH 浸泡處理后第1d， 150mg/L 濃度組SOD 活性與對照組[(403.26±25.76)U/mg prot]相 比， 顯 著 升 高 至(561.86±39.71)U/mg prot (P＜0.05)， 250 和350mg/L 濃度組SOD 活性極顯著升高 至 (574.25±63.36) 和 (583.96±64.17)U/mg prot (P＜0.01)， 標記后第2d 除150mg/L 組外， 其余兩組SOD 活性與對照組[(395.62±52.93)U/mg prot]無顯著差異， 從第5—22d 各組均恢復(fù)至與對照組無顯著差異的水平(圖6)。

2.4.3 肝臟CAT 活性的變化 TCH 浸泡后第1d， 150mg/L 濃度組CAT 活性與對照組[(20.48±2.88)U/mg prot] 相 比， 顯 著 升 高 至(26.52±0.93)U/mg prot (P＜0.05)， 250mg/L 濃度組CAT 活性與對照組相比極顯著升高至(39.18±4.03)U/mg prot (P＜0.01)， 350mg/L濃度組略有升高， 但不顯著， CAT 是與SOD 相關(guān)聯(lián)的抗氧化酶， 本實驗中其活性變化趨勢與SOD 基本一致； 在第 2d CAT 活性下降至與對照組水平[(23.60±2.82)U/mg prot]無顯著差異， 其中350mg/L 濃度組例外， CAT 活性在第2d 下降到(13.66±2.74)U/mg prot， 極顯著低于對照組(P＜0.01)， 到第5d 至22d 各濃度組均與對照組水平[(24.95±3.86)U/mg prot]無顯著差異(圖7)。

圖6 TCH 24h 浸泡處理對鰱肝臟超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響(n=9) Fig.6 Effect of TCH 24h immersion on liver superoxide dismutase (SOD) activity in silver carp (n=9)

圖7 TCH 24h 浸泡處理對鰱肝臟過氧化氫酶(CAT)活性的影響(n=9) Fig.7 Effect of TCH 24h immersion on liver catalase (CAT) activity in silver carp (n=9)

3 討論

3.1 TCH 熒光標記鰱耳石的效果

熒光標記能夠較好地用于短時間、大規(guī)模標記魚類(耿倩等， 2016)， TCH 作為熒光物質(zhì)已經(jīng)在魚類的標記放流中使用了近 50 年， 標記效果穩(wěn)定可靠(Weberet al， 1962)。對TCH 標記的魚類耳石目前多采用紫外激發(fā)光和藍色激發(fā)光進行觀察(何春林等， 2008； 郭鶴等， 2019)， 根據(jù)本實驗室前期斑馬魚的熒光浸泡標記研究結(jié)果(郭鶴等， 2019)， 本研究采用藍色激發(fā)光I3進行鰱魚種微耳石的熒光標記效果鑒定， 結(jié)果在TCH 各濃度組浸泡的鰱微耳石上均檢測到黃綠色熒光及標記輪， 并且隨著浸泡濃度增加， 耳石上的熒光強度也越明顯， 其中350mg/L 濃度的TCH 溶液浸泡標記效果最明顯。

藥餌投喂的各含量組鰱微耳石雖然可以被TCH標記， 但標記在熒光顯微鏡下觀察到的效果不穩(wěn)定， 標記效果在不同個體之間差異較大， 原因有幾個方面。一方面， 鰱雖然是濾食性魚， 但是食道對食物團的吞咽是主動的， 飼料中添加TCH 可能導(dǎo)致適口性下降， 導(dǎo)致攝食減少； 另一方面， 不同個體間在攝食量和腸道吸收上會有差異， 這些因素綜合疊加導(dǎo)致標記的均一性較差， 很難在同批次標記鰱的耳石上形成穩(wěn)定的熒光標記。比較兩種不同標記方式， 浸泡方式操作方便， 被標記魚是被動吸收， 結(jié)果均一， 因此， 本研究結(jié)果表明， 浸泡方式比藥餌投喂更適合對鰱魚種進行熒光標記。

在使用熒光物質(zhì)標記放流魚類時， 要綜合考慮熒光染料的成本、浸泡濃度、標記效果、對標記魚類的安全性及標記可保持時間等多方面因素(Tayloret al， 2005)。有研究表明四環(huán)素類熒光標記最長可保持3 年半(Lorsonet al， 1987； Yamadaet al， 1987)， 由此推斷TCH 標記鰱也可長時間保持沉積在骨質(zhì)的耳石中。此外， TCH 與茜素絡(luò)合物、鈣黃綠素和茜素紅S等其他熒光染料相比， 短時間可代謝的抗生素， 不會長時間殘留在魚體(徐維海等， 2004)， 食用是安全的。此外， 作為抗生素還可以預(yù)防或治療放流操作過程所致的損傷感染， 減少標記放流所造成的死亡。綜上分析， 對應(yīng)激反應(yīng)強， 操作易受損傷的鰱， TCH 熒光浸泡標記是一種較優(yōu)選擇。

3.2 TCH 浸泡標記對鰱肝功能的可逆性影響

TCH 作為熒光染料浸泡標記鰱魚種， 有較好的標記效果， 但是作為一種抗生素通過鰓、皮膚和消化道吸收難免會對標記魚體造成一定的生理影響。血清轉(zhuǎn)氨酶AST 和ALT 是廣泛存在于動物組織細胞線粒體內(nèi)的重要氨基轉(zhuǎn)移酶， 在機體蛋白質(zhì)代謝中起著重要的作用， 其變化能反映肝臟的損傷程度(De La Torreet al， 1999， 2000)。本研究為了解TCH 對鰱肝功能的影響， 檢測了血清兩種轉(zhuǎn)氨酶AST 和ALT 活性， 結(jié)果顯示在TCH 浸泡后1d， 150、250、350mg/L 三個濃度組鰱的血清轉(zhuǎn)氨酶均出現(xiàn)急性升高， 表明TCH浸泡對鰱造成急性肝功能損傷。但是AST 和ALT 的活性在浸泡后2—5d 即很快就恢復(fù)正常。文獻報道， 茜素紅S 浸泡中華倒刺 鲃引起的轉(zhuǎn)氨酶活性升高需要10d 后方可恢復(fù)正常水平(霍來江， 2015)， 此外， 四環(huán)素類藥物在吉富羅非魚體內(nèi)的消除半衰期為24h左右(徐維海等， 2004)， 本研究表明TCH 浸泡可能會造成鰱魚種肝功能短期急性損傷， 但這種損傷是可逆的， 隨著TCH 從魚體代謝清除， 魚體在短時間內(nèi)可自行恢復(fù)， 不會造成永久損傷。

3.3 TCH 浸泡標記對鰱肝臟的氧化損傷和抗氧化酶的保護作用

化學藥物浸泡對水生生物的影響是顯著的， 用于防治病害在水產(chǎn)養(yǎng)殖上廣泛應(yīng)用的抗生素類藥物， 其施用會引起魚體的氧化應(yīng)激， 使機體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基(ROS)(Bomzonet al， 2001； 李兆新等， 2017)， 當機體內(nèi)ROS 的含量快速增加超過機體的清除能力時， 就會對機體造成應(yīng)激損傷， 引起細胞脂質(zhì)過氧化、酶失活、DNA 損傷等反應(yīng)， 使組織細胞代謝失調(diào)， 機體隨之發(fā)生進行性的生理和病理改變(Livingstoneet al， 1990； Palaceet al， 1998)。MDA 是細胞脂質(zhì)氧化的代謝產(chǎn)物， 它反映了機體受氧化損傷的程度(Benliet al， 2008)。本研究結(jié)果顯示不同濃度的TCH 浸泡后1d 就導(dǎo)致了肝臟MDA 呈濃度依賴的極顯著升高， 表明鰱肝臟受到氧化損傷， 與此同時， 也檢測到肝臟兩種抗氧化酶SOD 和CAT 的活性也在同一時間呈濃度依賴的極顯著升高， 這是由于SOD 和CAT 是動物體內(nèi)主要的抗氧化酶， 它們通過協(xié)同作用保持細胞和機體的正常生理活動， 當TCH浸泡對肝臟造成氧化損傷時， 鰱肝細胞會大量合成SOD 和CAT 等抗氧化酶清除細胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的多余ROS。只有350mg/L 濃度組的CAT 活性出現(xiàn)下降， 推測可能是由于CAT 酶對過高濃度TCH 敏感而受到抑制所致。據(jù)文獻報道， 茜素紅S 浸泡中華倒刺鲃， 鈣黃綠素浸泡標記刺參， TCH 浸泡斑馬魚也得到了類似的結(jié)果(趙鵬等， 2011； 霍來江， 2015； 郭鶴等， 2019)。此外， 研究發(fā)現(xiàn)使用鈣黃綠素和茜素絡(luò)合物聯(lián)合標記中華倒刺 鲃， TCH 浸泡標記許氏平 鮋， 鈣黃綠素和茜素紅S 浸泡標記許氏平 鮋都可獲得良好的標記效果并且不會明顯影響其生存和生長， 這與本研究的結(jié)果也是一致的(Lüet al， 2014a， b， 2017)。鰱在處理2—5d 后抗氧化酶活性逐漸恢復(fù)到正常水平， 同樣是TCH 處理的斑馬魚則需要9d 才恢復(fù)正常水平。本研究結(jié)果顯示， 肝臟MDA 在急性升高后的第2d 就極顯著下降低于對照組， 直至第10—22d 逐漸恢復(fù)正常水平， 表明了鰱抗氧化系統(tǒng)有效而快速地清除肝細胞脂質(zhì)氧化的代謝產(chǎn)物這一過程。結(jié)果表明TCH 浸泡造成了鰱肝臟急性氧化應(yīng)激， 但魚體通過自身抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)可以有效避免應(yīng)激導(dǎo)致的永久損傷。因此不會影響鰱的野外存活， 這種標記對鰱是安全的。

4 結(jié)論

綜上， 采用TCH 浸泡標記鰱微耳石的方法比藥餌投喂熒光標記的效果更好， 更方便操作。350mg/L的TCH 溶液可以作為鰱魚種浸泡標記的參考濃度； 150—350mg/L 的TCH 溶液浸泡會導(dǎo)致鰱的肝功能短暫異常， 表現(xiàn)為血清轉(zhuǎn)氨酶急性升高和氧化應(yīng)激指標上升， 但這種肝臟應(yīng)激損傷可在短時間恢復(fù)正常， 表明TCH 浸泡方法是鰱標記放流的有效、安全、可靠的方法。本研究結(jié)果可為鰱的增殖放流、跟蹤監(jiān)測和效果評估工作提供技術(shù)支撐， 為其他魚類的標記放流提供參考。