田翠翠 陸勤勤 朱建一 鄧銀銀 胡傳明 許廣平 周 偉 ①

(1. 江蘇省海洋水產(chǎn)研究所 南通 226007； 2. 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺 南京 210014； 3. 常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 常熟 215500 )

皺紫菜(Pyropia crispataKjellman)(Sutherlandet al，2011)屬暖溫性海藻(黃淑芳， 2003)， 主要分布在浙江以南的東海和南海海域(朱建一等， 2016)。葉狀體圓形或腎臟形， 有裂片， 常呈花朵狀， 生長在海浪沖擊附近中潮帶的巖石上(鄭寶福等， 2009)。

紫菜作為我國重要的經(jīng)濟(jì)栽培海藻， 年凈產(chǎn)值約2.58 億美元(Blouinet al， 2010)。藻類學(xué)者較多關(guān)注的是兩大栽培物種條斑紫菜(P. yezoensis)和壇紫菜(P. haitanensis)， 并在其形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳育種及栽培等研究領(lǐng)域取得了令人矚目的進(jìn)展(許璞等， 2013)。近年來， 由溫室效應(yīng)引起的全球氣候變暖已經(jīng)給紫菜栽培業(yè)造成了影響(王華芝等， 2012)。因此， 紫菜耐高溫品種的選育引起了研究者的重視。陳偉洲等(2015)研究了長紫菜(P. dentata)、壇紫菜、皺紫菜的葉狀體對高溫脅迫的響應(yīng)能力， 發(fā)現(xiàn)皺紫菜耐高溫能力最強(qiáng)。為進(jìn)一步挖掘和開發(fā)紫菜種質(zhì)資源， 有必要開展皺紫菜栽培技術(shù)研究工作。紫菜殼孢子作為“種子”是人工育苗的關(guān)鍵， 殼孢子的萌發(fā)率直接影響到育苗效果， 進(jìn)而影響海上栽培的質(zhì)量和產(chǎn)量。因此， 研究溫度對殼孢子萌發(fā)的影響對紫菜的栽培具有重要意義。目前， 孔曉銳(2012)研究表明條斑紫菜殼孢子萌發(fā)最適溫度為20°C。趙素芬等(2012)認(rèn)為壇紫菜殼孢子附著和萌發(fā)的適宜溫度是23—25°C。陳佩等(2015)研究表明適合長紫菜殼孢子萌發(fā)的溫度為22—26°C。但關(guān)于溫度對皺紫菜殼孢子萌發(fā)的影響未見報(bào)道。

紫菜葉狀體早期呈現(xiàn)兩種不同的發(fā)育模式： 直線發(fā)育模式， 如條斑紫菜、壇紫菜； 兩側(cè)發(fā)育模式， 如半葉紫菜華北變種(P. katadaivar. hemiphylla)(王金鋒， 2007)。早期發(fā)育模式以及殼孢子細(xì)胞初始發(fā)生縱分裂位置對藻體的形態(tài)建成有很大的影響(朱建一等， 2016)。有研究發(fā)現(xiàn)圓紫菜(P. suborbiculata)殼孢子初始縱分裂發(fā)生時(shí)間較早是藻體為圓形或腎臟形的原因之一(楊秀文等， 2019)。皺紫菜的外形與圓紫菜相近， 葉狀體形態(tài)建成未見報(bào)道。

本文采用皺紫菜自然種群制備成絲狀體種質(zhì)并接種貝殼， 通過貝殼絲狀體的培育獲取殼孢子。觀察了不同培養(yǎng)溫度對皺紫菜殼孢子萌發(fā)的影響， 并探討了皺紫菜葉狀體早期發(fā)育模式、形態(tài)建成過程、繁殖等生物學(xué)特性， 以期為皺紫菜的研究及人工栽培新物種開發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 種質(zhì)制備及貝殼絲狀體的培育

皺紫菜采自廣東南澳島(23°20′N， 116°55′E)巖礁上分布的野生種群， 按照國家級紫菜種質(zhì)庫(江蘇省海洋水產(chǎn)研究所， 南通)種質(zhì)制備技術(shù)流程進(jìn)行種質(zhì)制備及保存(朱建一等， 2016)。將自由絲狀體用食品粉碎機(jī)切割至200—300μm， 根據(jù)(200—300)ind./cm2的投放密度噴灑到附著基質(zhì)文蛤殼上。培養(yǎng)條件為： 溫度23°C、光密度40μmol/(m2·s)、光周期12L︰12D。當(dāng)絲狀藻絲布滿整個(gè)文蛤殼面時(shí)， 培養(yǎng)條件為： 溫度(29±1)°C， 光密度 10—20μmol/(m2·s)， 光周期 8L︰16D， 期間每7d 更換一次MES 培養(yǎng)液(王素娟等， 1986)， 以促進(jìn)貝殼絲狀體大量形成孢子囊枝。當(dāng)殼面由暗紅色轉(zhuǎn)為紅褐色時(shí)， 即標(biāo)志著絲狀體已經(jīng)成熟。

1.2 殼孢子收集及萌發(fā)率比較試驗(yàn)

將成熟的絲狀體貝殼表面刷洗干凈后， 放入高溫滅菌海水中， 水溫降至(25±1)°C， 充氣培養(yǎng)以促進(jìn)殼孢子放散。每天早上6 點(diǎn)左右將洗刷干凈后的貝殼放入裝有100mL 滅菌海水中， 早上9—10 點(diǎn)將海水?dāng)嚢杈鶆蚴占派⒌臍ゆ咦?。皺紫菜殼孢子萌發(fā)試驗(yàn)置光照培養(yǎng)箱(SANYO MLR-351， 日本)中進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)4 個(gè)溫度組(15、20、25、28°C)， 每個(gè)溫度做4 個(gè)平行樣。培養(yǎng)條件均為光照40μmol/(m2·s)， 光周期12L︰12D， 鹽度26。將上述收集的殼孢子滴放在載玻片上， 顯微鏡下計(jì)數(shù)殼孢子總數(shù)。參考孔曉銳(2012)的方法， 靜置培養(yǎng)24h 后， 用顯微鏡(Nikon 90i， 日本)觀察并記錄殼孢子萌發(fā)情況， 連續(xù)統(tǒng)計(jì)4d。統(tǒng)計(jì)并計(jì)算其萌發(fā)率和萌發(fā)率的絕對增長速率， 公式如下：

萌發(fā)率=萌發(fā)的殼孢子/殼孢子總數(shù)×100%， (1) 萌發(fā)率的絕對增長速率=(第4d 的萌發(fā)率-第1d 的萌 發(fā)率)/4. (2)

1.3 殼孢子苗發(fā)育模式及葉狀體形態(tài)建成觀察

在顯微鏡下觀察殼孢子苗的生長發(fā)育情況。通過觀察殼孢子第一、二次的細(xì)胞分裂形式， 了解皺紫菜葉狀體早期發(fā)育模式。測定幼苗長度及長寬比， 探討皺紫菜葉狀體的形態(tài)建成。

1.4 繁殖特性觀察

通過對皺紫菜定期干出[即將附著藻體的玻片或藻體取出置于篩絹上， 15—20°C 的空氣中， 光照強(qiáng)度40μmol/(m2·s)， 1h]， 觀察藻體是否放散單孢子及單孢子放散時(shí)間、放散量等， 判斷其是否存在無性生殖。觀察藻體是否形成雌雄生殖細(xì)胞， 以及是否放散果孢子形成絲狀體， 以確定其是否具有有性生殖。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism 7.0 和Origin 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。用One-Way ANOVA檢驗(yàn)差異的顯著水平， 設(shè)顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度下殼孢子萌發(fā)情況

不同溫度條件下殼孢子萌發(fā)率不同。第 1 天， 15°C 溫度組殼孢子萌發(fā)率與20、25 和28°C 溫度組均無顯著性差異(P＞0.05)， 但第3 天， 15°C 溫度組與20、25 和28°C 溫度組有顯著性差異(P＜0.05)(圖1)， 且15°C 溫度組下殼孢子萌發(fā)率的絕對增長速率最小， 僅為4.43% (圖2)， 說明低溫會使殼孢子的萌發(fā)速度減緩。4 天中20、25、28°C 溫度組之間無顯著性差異(P＞0.05)， 其中28°C 溫度組前3 天的萌發(fā)率與20、25°C 組相近； 第4 天， 20°、25°C 溫度組萌發(fā)率顯著提高， 但28°C 溫度組萌發(fā)率沒有明顯提高， 且觀察 顯示萌發(fā)幼苗出現(xiàn)變綠死亡現(xiàn)象， 說明該溫度不適合皺紫菜殼孢子的萌發(fā)。20 和25°C 溫度組萌發(fā)率相近，結(jié)合殼孢子萌發(fā)率絕對增長速率比較來看， 20—25°C是皺紫菜殼孢子萌發(fā)適宜溫度， 20°C 為最適溫度。

圖1 不同溫度對皺紫菜殼孢子萌發(fā)的影響(n=4) Fig.1 The effects of temperature on conchospore germination of P. crispata (n=4)

圖2 不同溫度對殼孢子萌發(fā)率絕對增長速率的影響 Fig.2 The effects of temperature on absolute growth rates of conchospore germination

2.2 不同溫度下早期發(fā)育模式

4 個(gè)試驗(yàn)組的殼孢子苗早期發(fā)育模式均為直線發(fā)育模式。剛釋放的殼孢子無細(xì)胞壁， 可做變形運(yùn)動， 附著后即開始萌發(fā)， 孢子拉長， 色素體移向頂端(圖3a)。殼孢子第一次分裂為極性分裂， 經(jīng)橫分裂形成上下兩個(gè)細(xì)胞， 一個(gè)為頂端細(xì)胞， 另一個(gè)靠附著基質(zhì)的為基部細(xì)胞(圖3b)?；考?xì)胞色素體偏位較小、液泡較大， 并逐漸伸長形成假根。第二次分裂仍為橫分裂， 兩個(gè)細(xì)胞的分裂不一定同步， 會形成3 個(gè)或4 個(gè)細(xì)胞的幼苗(圖3c， 3d)。隨著更多次的細(xì)胞分裂， 殼孢子逐漸形成幾個(gè)細(xì)胞呈直線排列的幼苗(圖3e)。當(dāng)發(fā)育至7—10 個(gè)細(xì)胞后， 幼苗細(xì)胞開始出現(xiàn)縱分裂， 縱分裂一般由幼苗中部細(xì)胞先開始， 逐漸向梢部及基部發(fā)展， 幼苗橫向變寬呈“梭子形”(圖3f， 3g， 3h)。

2.3 不同溫度下形態(tài)建成過程

不同溫度對皺紫菜形態(tài)建成過程略有影響。15、20°C 溫度組形態(tài)建成過程相似， 藻體多為不規(guī)則的半圓形裂片。25、28°C 溫度組形態(tài)建成過程相似， 藻體多為細(xì)長型葉片。

培養(yǎng)10d， 15、20°C 溫度組葉狀體基部細(xì)胞不具生長勢， 分裂緩慢， 逐漸向下伸出假根絲。中部細(xì)胞具生長優(yōu)勢， 分裂較梢部細(xì)胞快， 藻體逐漸變寬(圖4a)， 長寬比為2.3—3.5 (圖5)。溫度越高， 幼苗長寬比越大， 28°C 溫度組幼苗長寬比(4.6)是15°C 溫度組(2.3)的兩倍。25、28°C 溫度組幼苗呈細(xì)長形(圖4e)。

圖3 皺紫菜的早期發(fā)育過程 Fig.3 The early development of P.crispata

培養(yǎng)20d， 15、20°C 溫度組幼苗中部細(xì)胞縱分裂速度快于基部細(xì)胞， 使基部細(xì)胞逐漸向內(nèi)旋轉(zhuǎn)(圖4b)。25、28°C 溫度組幼苗長寬比由(4—4.6)增加到(4.4—5.4)， 藻體進(jìn)一步變細(xì)長(圖4f)。

培養(yǎng)30d， 由于藻體細(xì)胞分裂速度的差異， 縱分裂速度大于橫分裂， 幼苗長寬比變小。15、20°C 溫度組幼苗基部細(xì)胞進(jìn)一步向內(nèi)旋轉(zhuǎn)， 中部細(xì)胞形成的圓弧形組織逐漸占葉狀體主導(dǎo)(圖4c)。25、28°C 溫度組幼苗已形成披針形小葉狀體(圖4g)。

培養(yǎng)40d， 15°C 溫度組已形成半圓形不規(guī)則裂片(圖4d)， 幼苗長寬比由原來的2.3 減小至1.5。25°C溫度組幼苗形成基部呈褶皺狀、長形葉狀體(圖4h)。28°C 溫度組幼苗細(xì)胞由于受高溫刺激， 細(xì)胞分裂受阻， 藻體逐漸腐爛死亡。

2.4 不同溫度下皺紫菜的繁殖

圖4 皺紫菜形態(tài)建成過程 Fig.4 The blade morphogenesis of P.crispata

圖5 不同溫度皺紫菜殼孢子幼苗長寬比 Fig.5 The effects of temperature on the ratio length-to-width of P. crispate blades

對皺紫菜殼孢子幼苗干出后放散觀察結(jié)果： 培 養(yǎng)50d， 15°C 溫度組部分藻體頂端、邊緣等部位細(xì)胞間排列較疏松(圖6a)， 干出后即可見放散出類似單孢子的細(xì)胞， 細(xì)胞呈橢圓形或圓形(圖 6b)， 每株藻體約統(tǒng)計(jì)到60 個(gè)孢子。20°C 溫度組同樣是藻體前端邊緣細(xì)胞疏松部位有類單孢子放散出來， 放散量較少， 每株藻體約30 個(gè)孢子。靜置培養(yǎng)下， 有些孢子已原位萌發(fā)成幾個(gè)細(xì)胞的小苗(圖6c， )。25 和28°C溫度組的殼孢子苗整個(gè)培養(yǎng)過程中均未發(fā)現(xiàn)有類單孢子放散的現(xiàn)象， 且分別培養(yǎng)至50、40d 后藻體逐漸發(fā)白腐爛。

培養(yǎng)60d 后， 15 和20°C 溫度組藻體先后在藻體邊緣出現(xiàn)有性生殖細(xì)胞。首先觀察到的是沿藻體前端邊緣形成雄性精子囊器細(xì)胞， 并逐漸延伸分布至藻體中、后部區(qū)域， 隨著精子囊器細(xì)胞的分裂成熟， 細(xì)胞內(nèi)色素逐漸減淡， 成熟時(shí)呈金黃色(圖6d)。成熟的單個(gè)精子囊器含64 個(gè)精子囊， 分裂式為♂A4B4C4(圖6e)， 精子囊器細(xì)胞成熟后開始放散精子， 精子球形， 直徑3—5μm， 無游動能力(圖6f)。雌性果孢子囊的區(qū)域呈現(xiàn)深紫紅色(圖6g)， 果孢子囊內(nèi)含有32 個(gè)果孢子， 分裂式為♀A4B2C4(圖6h)， 成熟后放散出的果孢子球形(圖6i)， 直徑10—15μm， 紅褐色， 萌發(fā)形成絲狀體。

3 討論

3.1 溫度對殼孢子萌發(fā)生長的影響

圖6 皺紫菜的繁殖 Fig.6 The reproduction of P. crispata

萌發(fā)試驗(yàn)顯示， 15°C溫度組萌發(fā)率低， 表明該溫度不適合皺紫菜殼孢子的萌發(fā)； 20、25、28°C溫度組之間無顯著性差異(P＞0.05)， 但28°C組幼苗出現(xiàn)死亡現(xiàn)象， 顯然該溫度同樣不適合皺紫菜殼孢子的萌發(fā)。結(jié)合萌發(fā)率絕對增長速率比較來看， 20—25°C是皺紫菜 殼孢子萌發(fā)適宜溫度。此研究結(jié)論與趙素芬等(2012)對壇紫菜殼孢子萌發(fā)適宜溫度23—25°C、陳佩等(2015)對長紫菜殼孢子萌發(fā)適宜溫度22—26°C相似。然而對殼孢子萌發(fā)后葉狀體的生長跟蹤來看， 盡管25°C溫度對殼孢子萌發(fā)適宜， 持續(xù)時(shí)間長了并非完全有利， 說明殼孢子可以忍受短期25°C的水溫， 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長， 幼苗對高溫的耐力逐漸降低， 葉狀體生長受阻出現(xiàn)發(fā)白腐爛現(xiàn)象。因此， 本文認(rèn)為20°C是皺紫菜殼孢子幼苗生長的適宜水溫。這一結(jié)論與陳偉洲等(2013)的皺紫菜的適宜生長溫度為17—23°C， 最適宜溫度為20°C一致。而與湯曉榮等(1998)對條斑紫菜幼苗生長的適溫18—20°C存在一定差異， 說明紫菜殼孢子生長的條件與紫菜的種類有關(guān)。

目前南方沿海已將皺紫菜作為新開發(fā)的紫菜人工栽培物種， 根據(jù)上述試驗(yàn)的結(jié)果， 從栽培生產(chǎn)安全的角度來看， 皺紫菜的殼孢子采苗時(shí)間應(yīng)該安排在栽培海區(qū)水溫降至20—25°C期間進(jìn)行， 有利于皺紫菜殼孢子苗的生長與發(fā)育。

3.2 葉狀體早期發(fā)育模式及形態(tài)建成

本試驗(yàn)4 種溫度培養(yǎng)條件下， 皺紫菜殼孢子萌發(fā)過程均顯示為直線發(fā)育模式， 與條斑紫菜、壇紫菜、少精紫菜(P. oligospermatangia)、圓紫菜和紅毛菜的殼孢子發(fā)育模式相同(王金鋒， 2007； Wanget al，2010)， 皺紫菜殼孢子萌發(fā)過程及分裂初期具有直線生長的特點(diǎn)。

紫菜殼孢子細(xì)胞縱分裂初始發(fā)生位置影響藻體形態(tài)建成(朱建一等， 2016)。楊秀文等(2019)發(fā)現(xiàn)圓紫菜殼孢子發(fā)育至7—9 細(xì)胞時(shí)開始縱分裂， 認(rèn)為初始縱分裂發(fā)生時(shí)間較早是藻體為圓形或腎臟形的原因之一。皺紫菜的外形與圓紫菜相近， 是什么原因引起皺紫菜葉狀體形態(tài)的變化？根據(jù)本試驗(yàn)觀察結(jié)果顯示： 當(dāng)殼孢子發(fā)育至7—10 細(xì)胞后， 藻體開始出現(xiàn)縱向分裂， 藻體長寬比逐漸變小是影響皺紫菜形態(tài)建成的因素之一， 這一細(xì)胞分裂形式為藻體形成弧形或扇形提供了基礎(chǔ)； 另外中部與梢部細(xì)胞分裂速度不同步， 中部細(xì)胞分裂較快形成圓弧形裂片， 梢部細(xì)胞逐漸分裂變長， 從而使藻體形成不規(guī)則的半圓形裂片。同時(shí)， 不同溫度對藻體形態(tài)略有影響， 15°C 溫度組圓形或半圓形藻體較其他組多， 25、28°C 溫度組更多是基部呈褶皺狀、有一個(gè)較大、長形主裂片的葉狀體。

3.3 繁殖特性

紫菜屬物種幾乎都具有性生殖， 有的物種生活史中還可兼無性生殖(Blouinet al， 2010)。例如： 條斑紫菜(梅俊學(xué)等， 2001)、甘紫菜(P. tenera)(曾呈奎等， 1954)、圓紫菜(Caoet al， 2019)、擬線性紫菜(P. pseudolinearis)(Yanagisawaet al， 2019)的葉狀體可以釋放單孢子。這一繁殖特性在栽培生產(chǎn)中對幼苗的補(bǔ)充起著很大的作用， 所以， 研究單孢子的形成及放散量并在栽培生產(chǎn)中加以利用具有重要意義。

本研究對皺紫菜繁殖特性觀察顯示， 在15—20°C范圍內(nèi)， 少部分皺紫菜藻體邊緣可放散類單孢子， 且15°C 溫度組藻體的孢子放散量大于20°C 溫度組， 顯示較低溫度有利于皺紫菜邊緣細(xì)胞形成類單孢子及其放散。然而與條斑紫菜放散單孢子為繁殖特性相比， 皺紫菜的類單孢子放散不具有普遍性和共性， 對于皺紫菜是否具無性生殖仍需進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)培養(yǎng)結(jié)果顯示， 有性生殖是皺紫菜的主要繁殖方式。

4 結(jié)論

通過觀察、測定不同溫度下對皺紫菜的殼孢子萌發(fā)率和藻體生長情況， 揭示皺紫菜殼孢子萌發(fā)生長適宜溫度為20—25°C， 最適溫度為20°C?；诒狙芯拷Y(jié)果， 建議皺紫菜的殼孢子采苗時(shí)間安排在栽培海區(qū)水溫降至20—25°C 期間進(jìn)行。試驗(yàn)顯示， 溫度對皺紫菜的形態(tài)建成有一定影響， 15、20°C 溫度組藻體多為不規(guī)則的半圓形裂片， 25、28°C 溫度組藻體多為細(xì)長型葉片， 溫度越高， 藻體形態(tài)越細(xì)長。對皺紫菜繁殖方式的初步研究顯示， 有性生殖是其主要的繁殖方式， 但低溫組(15、20°C)部分藻體可以產(chǎn)生少量與單孢子類似的無性繁殖細(xì)胞。