熊世雙 ，陳曉文，穆亞男，張德瑞，蔣金芳，李軍，曹玉文

0 引言

Pim1分子是絲/蘇氨酸激酶家族重要成員，與多種腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切[1-4]，Pim1在乳腺癌中異常表達(dá)，其高表達(dá)與乳腺癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER表達(dá)密切相關(guān)[5]。Pim1調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄激活，Notch1分子被確定為Pim1下游目標(biāo)[6]。乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞Pim1激酶促進(jìn)Notch1磷酸化，增強(qiáng)Notch1核定位和轉(zhuǎn)錄活性[7]。目前，Pim1和Notch1在乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞癌變過(guò)程中的表達(dá)狀況以及與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系研究甚少，因此，我們應(yīng)用qRTPCR、免疫組織化學(xué)及數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)Pim1和Notch1在乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞癌變過(guò)程中的表達(dá)，分析與乳腺癌臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，以期為乳腺癌早期診斷及臨床治療提供一定的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

收集2000年1月—2010年9月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科石蠟包埋組織乳腺癌旁正常組織（ANBT，距乳腺癌組織至少5 cm以上）37例、乳腺普通型導(dǎo)管增生（UDH）40例、乳腺導(dǎo)管原位癌（DCIS）32例和乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌（IDC）200例。所有患者術(shù)后均經(jīng)病理確診為浸潤(rùn)性乳腺癌，排除術(shù)前放化療或內(nèi)分泌治療和合并有其他嚴(yán)重疾病患者。同時(shí)收集患者臨床病理資料，包括組織分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER、PR、HER2表達(dá)。所有患者簽署知情同意書(shū)，石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 使用Oligo7.0設(shè)計(jì)引物，引物序列：Pim1：上游引物：5′-GAGAAGGACCGGATTTCCGAC-3′，下游引物：5′-CAGTCCAGGAGCCTAATGACG-3′；Notch1：上游引物：5′-TGGACCAGATTGGGGAGTTC-3′，下游引物：5′-GCACACTCGTCTGTGTTAC-3′；β-actin：上游引物：5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物：5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。由上海生工生物工程公司合成引物。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)Pim1和Notch1 mRNA的表達(dá) 乳腺組織中總RNA用RNeasy FFPE試劑盒（目錄號(hào)73504，QIAGEN，德國(guó)）提取，根據(jù)Reverse Transcription Kit，加入反轉(zhuǎn)錄酶Superscript Ⅲ，反轉(zhuǎn)錄出cDNA，在帶有Fast SYBR Green Master Mix的7500 Fast Real-Time PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，Carlsbad，CA，美國(guó)）上進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR反應(yīng)條件即50℃溫育2 min，95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，62℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。以人β-actin mRNA的表達(dá)進(jìn)行歸一化，即ΔCt=CtPim1/Notch1-Ctβ-actin。

1.2.3 免疫組織化學(xué)Envision二步法檢測(cè)Pim1和Notch1蛋白表達(dá) 蠟塊連續(xù)3 μm厚切片，脫蠟、水化、檸檬酸鹽高壓抗原修復(fù)，加一抗（Pim1抗體，Abcam，1:100；或Notchl抗體，SIGMA，1:300），4℃冰箱孵育過(guò)夜，加二抗、DAB顯色、蘇木精對(duì)比染色、中性樹(shù)脂封片。顯微鏡下觀察，兩位資深病理醫(yī)師雙盲法判讀結(jié)果，陽(yáng)性結(jié)果根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度分值相乘，得分范圍0～12分，中位值4為分界值，≥4分為高表達(dá)，＜4分為低表達(dá)。

1.2.4 Oncomine在線數(shù)據(jù)庫(kù)（www.oncomine.org）[8]分析Pim1和Notch1 mRNA表達(dá) 數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)置限定條件：（1）基因：Pim1/Notch1；（2）腫瘤類型：乳腺癌；（3）分析類型：癌和正常組織；（4）數(shù)據(jù)類型：mRNA；（5）臨界值設(shè)定（P＜0.05；倍數(shù)變化=所有；基因排名=前10）。采用箱狀圖展示結(jié)果。

1.2.5 GEPIA在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn/） 分析Pim1和Notch1蛋白在乳腺組織中的表達(dá)，結(jié)果以箱式圖表示。

1.2.6 UALCAN在線工具（http://ualcan.path.uab.edu） 分析Pim1和Notch1蛋白與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[9]。

1.2.7 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)（http://kmPlot.com/analysis/） 對(duì)Pim1和Notch1表達(dá)與乳腺癌預(yù)后關(guān)系進(jìn)行生存分析[10]。數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)置條件：（1）腫瘤：乳腺癌；（2）基因：Pim1/Notch1；（3）生存期：總生存期（OS）/無(wú)復(fù)發(fā)生存期（RFS）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Pim1和Notch1 mRNA水平以及蛋白的表達(dá)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述。組間差異比較用非參秩和（兩組間用Mann-Whitney U檢驗(yàn)、三組及以上用Kruskal-Wallis H）檢驗(yàn)，兩變量相關(guān)性分析用Pearson秩相關(guān)，構(gòu)成比及其他資料差異的分析用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Pim1和Notch1在乳腺癌變過(guò)程中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示Pim1 mRNA在乳腺癌旁正常組織、普通型導(dǎo)管增生、導(dǎo)管原位癌、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P=1.105），見(jiàn)圖1A，四組中兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1B，Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)Pim1 mRNA在乳腺癌中表達(dá)略高于正常組織，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.063），見(jiàn)圖1C。Notch1 mRNA在從正常到浸潤(rùn)癌組織中的表達(dá)逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），見(jiàn)圖1D，各組中兩兩比較，除ANBT和UDH組外，其余各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1E，數(shù)據(jù)庫(kù)顯示Notch1 mRNA在乳腺癌中水平也高于正常乳腺組織，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.213），見(jiàn)圖1F。

Pim1蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示其定位于乳腺上皮細(xì)胞核，見(jiàn)圖2A，從正常到浸潤(rùn)癌四組中的陽(yáng)性表達(dá)逐漸降低，見(jiàn)圖2B，組間兩兩比較，Pim1蛋白在ANBT中表達(dá)明顯高于DCIS（P=0.008）和IDC（P=0.019）組，在UDH中表達(dá)亦明顯高于DCIS（P=0.005）和IDC（P=0.004）組，見(jiàn)圖2C，GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)乳腺癌中Pim1蛋白水平顯著低于正常組織，見(jiàn)圖2D。Notch1蛋白定位于乳腺上皮細(xì)胞質(zhì)，見(jiàn)圖2A，從正常乳腺到浸潤(rùn)癌組中表達(dá)逐漸升高，見(jiàn)圖2E，各組中進(jìn)行兩兩比較，除DCIS和IDC組（P=0.001）外，其余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2F，GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示正常組織Notch1蛋白水平高于乳腺癌組織，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2G。Pim1和Notch1蛋白在乳腺癌中表達(dá)相關(guān)性分析，顯示二者呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.385,P=0.001），見(jiàn)表1。

表1 Pim1和Notch1蛋白表達(dá)相關(guān)性Table 1 Association between Pim1 and Notch1 of protein expression

2.2 Pim1和Notch1表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

Pim1 mRNA表達(dá)與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM晚期顯著相關(guān)。Notch1 mRNA與組織學(xué)3級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，Pim1蛋白低表達(dá)與乳腺癌高分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER陰性、PR陽(yáng)性和HER2陰性顯著相關(guān)。Notch1蛋白高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，見(jiàn)表2。UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)Pim1 mRNA在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM晚期、ER與PR和HER2陽(yáng)性的表達(dá)顯著降低，見(jiàn)圖3A～C。Notch1 mRNA與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM晚期、ER與PR和HER陰性顯著相關(guān)，見(jiàn)圖3D～F。

圖1 乳腺組織Pim1和Notch1 mRNA表達(dá)Figure 1 Pim1 and Notch1 mRNA expression in breast tissues

圖2 乳腺組織Pim1和Notch1蛋白表達(dá)Figure 2 Pim1 and Notch1 protein expression in breast tissues

表2 Pim1和Notch1中蛋白和mRNA與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性Table 2 Correlation of Pim1/Notch1 protein and mRNA with clinicopathological features of breast cancer patients

2.3 Pim1和Notch1表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

圖3 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中Pim1、Notch1 mRNA表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)關(guān)系Figure 3 Relation between Pim1,Notch1 mRNA expression and clinicopathological parameters of breast cancer patients from UALCAN database

Kaplan-Meier Plotter對(duì)Pim1 mRNA與預(yù)后數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，結(jié)果顯示，209193_at基因芯片中，Pim1低表達(dá)的乳腺癌患者總生存期及無(wú)復(fù)發(fā)生存期明顯縮短（P=0.000），見(jiàn)圖4A～B。218902_s_at基因芯片中，Notch1高表達(dá)患者總生存時(shí)間顯著減少（P=0.025），見(jiàn)圖4C，無(wú)復(fù)發(fā)生存期縮短，見(jiàn)圖4D。

3 討論

有文獻(xiàn)報(bào)道Pim1 mRNA在乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)升高[7,11-13]，也有研究發(fā)現(xiàn)Pim1在非小細(xì)胞肺癌中下調(diào)[14]，說(shuō)明Pim1 mRNA在不同腫瘤中表達(dá)水平不一致，可能受多種因素的影響。Pim1蛋白在乳腺癌變過(guò)程中的表達(dá)逐漸降低，尤其在浸潤(rùn)性乳腺癌中顯著低表達(dá)，GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)也驗(yàn)證了該結(jié)果，提示Pim1蛋白在乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞癌變過(guò)程中可能充當(dāng)抑癌基因角色，Pim1蛋白表達(dá)對(duì)乳腺組織來(lái)說(shuō)是一個(gè)保護(hù)因素，也有文獻(xiàn)報(bào)道Pim1蛋白促進(jìn)乳腺細(xì)胞癌變和增殖[15-16]。Pim1表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析顯示，Pim1 mRNA表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM晚期顯著相關(guān)，提示Pim1 mRNA表達(dá)可能促進(jìn)乳腺癌惡性進(jìn)展及轉(zhuǎn)移，有學(xué)者報(bào)道Pim1參與了三陰性乳腺癌的細(xì)胞增殖、遷移和凋亡，沉默Pim1基因可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)對(duì)化療的敏感度[17]，說(shuō)明Pim1作為癌基因參與乳腺腫瘤的進(jìn)展。

UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，Pim1 mRNA在TNM晚期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中顯著降低，與本研究結(jié)果相符，提示Pim1可能承擔(dān)著減緩乳腺癌惡性程度的角色。以上研究結(jié)果出現(xiàn)不一致，可能與乳腺癌樣本量、分子分型、檢測(cè)方法及敏感度等有關(guān)，提示需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、分層細(xì)化研究對(duì)象、標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法等。我們進(jìn)一步使用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)顯示Pim1蛋白低水平的乳腺癌患者總生存期和無(wú)復(fù)發(fā)生存期明顯降低，提示Pim1分子是乳腺癌預(yù)后的一個(gè)保護(hù)性因素。本研究結(jié)果及數(shù)據(jù)庫(kù)分析提示，Pim1分子與乳腺癌變、進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)。

圖4 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中Pim1和Notch1 mRNA表達(dá)與乳腺癌預(yù)后關(guān)系Figure 4 Relation between Pim1/Notch1 mRNA expression and prognosis of breast cancer patients from Kaplan-Meier Plotter database

Notch1基因在乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞癌變過(guò)程中的表達(dá)有明顯變化，Notch1 mRNA水平呈顯著增高趨勢(shì)，與Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析Notch1 mRNA在正常組和浸潤(rùn)癌組中的差異性表達(dá)趨勢(shì)相同，提示可能作為癌基因角色促進(jìn)乳腺癌變。Notch1蛋白在乳腺癌變組織中表達(dá)逐漸升高，與Notch1 mRNA表達(dá)一致，進(jìn)一步提示Notch1發(fā)揮癌基因的作用，這與GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果相反，這可能與不同檢測(cè)人群、標(biāo)本數(shù)量等有關(guān)，此外，本研究結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道[18-19]均發(fā)現(xiàn)Notch1分子在正常上皮的水平分別顯著低于普通型增生、原位癌和浸潤(rùn)癌組，在原位癌和浸潤(rùn)癌組中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)Notch1分子可能在乳腺早期癌變階段起促進(jìn)作用，與乳腺癌晚期浸潤(rùn)無(wú)明顯相關(guān)性。分析Notch1與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Notch1 mRNA和蛋白表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[7,13,20]相同，表明Notch1表達(dá)可能促進(jìn)乳腺癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，此外，Notch1 mRNA與乳腺癌高分級(jí)密切相關(guān)，數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)Notch1 mRNA在TNM晚期、三陰性乳腺癌患者中表達(dá)顯著增高，還有研究顯示Notch1蛋白表達(dá)與組織學(xué)高分級(jí)和高分期顯著正相關(guān)[21]，與本研究結(jié)果相似，提示Notch1基因表達(dá)與乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)展的指標(biāo)明顯有關(guān)。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示Notch1高表達(dá)的乳腺癌患者總生存時(shí)間更短，與文獻(xiàn)報(bào)道[15,22-23]的研究結(jié)果相一致，說(shuō)明Notch1分子為促癌因子，高水平Notch1分子可能與乳腺癌預(yù)后不良相關(guān)。上述研究提示Notch1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起著促進(jìn)作用。

我們進(jìn)一步分析Pim1和Notch1蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示二者呈顯著負(fù)相關(guān)，提示Pim1和Notch1分子在乳腺癌變進(jìn)展過(guò)程中可能起著負(fù)性協(xié)同作用，本研究結(jié)果僅觀察到Pim1和Notch1分子的表達(dá)相關(guān)性，雖然目前有一篇文獻(xiàn)報(bào)道Pim1磷酸化調(diào)控下游分子Notch1[7]，但二者的具體關(guān)系和作用機(jī)制將是我們下一步的研究方向。

本研究初步分析了Pim1和Notch1在乳腺癌中的表達(dá)和臨床意義，為探討Pim1和Notch1信號(hào)通路在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了前期研究基礎(chǔ)，為乳腺癌預(yù)后判斷提供了理論依據(jù)。