余杰，楊鋒，鄧健，胡林旺

0 引言

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是常見的以快速轉(zhuǎn)移和侵襲性浸潤為特征的顱內(nèi)惡性腫瘤。根據(jù)2016年提出的《世界衛(wèi)生組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類》，膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是最常見的惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤類型，即使經(jīng)過系統(tǒng)治療，GBM患者的平均生存時間也只有15個月[1-2]。證據(jù)表明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度可能歸因于影響腫瘤進展中的各種癌基因表達和細胞間的分子轉(zhuǎn)導途徑[3]。探索膠質(zhì)瘤侵襲性發(fā)展的分子機制可能為其治療提供新的治療靶點。

雙皮質(zhì)素樣激酶1（doublecortin-like kinase 1,DCLK1）是一種微管相關激酶，在多種腫瘤中均過表達[4-6]。有研究表明，DCLK1的高表達能促進肝癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌等惡性腫瘤細胞的生長、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[5-7]，但DCLK1對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖活性、遷移和侵襲能力的作用尚不清楚。因此，本實驗探討下調(diào)DCLK1對膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并對其機制進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 胎牛血清（FBS）、Dulbecco改良版Eagle培養(yǎng)基（DMEM ）購自美國Life Technologies公司；LipofectamineTM2000和Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；DCLK1抗體購自英國Abcam公司；MTT細胞增殖試劑盒和免疫組織化學試劑盒購自廣州賴德生物技術有限公司；RIPA緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒和β-actin抗體購自上海碧云天生物科技有限公司；TGF-β1、p-Smad2、p-Smad7、Smad2和Smad7抗體購自美國Cell Signaling Technologies公司；PrimeScript RT和SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自日本Takara公司。

1.1.2 組織樣本收集 本研究共納入25例經(jīng)病理檢查確診為成人膠質(zhì)母細胞瘤患者（WHO Ⅱ～Ⅲ級），膠質(zhì)母細胞瘤組織和相應的癌旁組織均在接受腫瘤切除術中獲取。組織分為兩部分，一部分組織用于制作石蠟包埋，另外一部分組織保存在-80℃冰箱。在組織收集之前，患者均未接受過放化療。本研究獲得湖南省人民醫(yī)院倫理委員會的批準，且所有納入研究的受試者均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 取膠質(zhì)瘤和相應癌旁組織的石蠟組織，制作5 μm的石蠟切片。切片經(jīng)脫蠟和水化后，根據(jù)免疫組織化學試劑盒說明書步驟，通過鏈霉親和素-過氧化物酶（SP）的免疫組織化學染色評估DCLK1表達。孵育DCLK1抗體稀釋度為1:200。DAB顯色，光學顯微鏡隨機拍攝5個視野。根據(jù)以下標準對染色結(jié)果評分：0:＜5%;1:5%～25%;2:25%～50%;3:50%～75%;4:≥75%。得分＜1為陰性染色，≥1為陽性染色。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87、A172和正常神經(jīng)膠質(zhì)細胞HEB購自上海生物科學研究所細胞庫。將細胞接種在含有10%FBS的DMEM中，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每2～3天更換一次細胞培養(yǎng)基。sh-DCLK1和相應陰性對照（sh-Con）序列由中國吉凱基因公司合成。將獲得的序列克隆到pLV-shRNA質(zhì)粒中，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染至U87和A172細胞48 h 后，Western blot檢測DCLK1的相對表達以評估轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3 MTT檢測 將已轉(zhuǎn)染sh-DCLK1或sh-Con的U87和A172細胞接種到96孔板中。37℃、5%CO2下分別孵育0、24、48和72 h，每孔分別添加20 μl MTT試劑（5 mg/ml），并室溫孵育4 h，然后加入150 μl DMSO溶解結(jié)晶，通過酶標儀（TECAN，奧地利）讀取各孔450 nm處的吸光度值。

1.2.4 細胞遷移和侵襲實驗 取已轉(zhuǎn)染sh-DCLK1或sh-Con的U87和A172細胞，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至5×105個/毫升，并取100 μl細胞懸液加入Transwell板上室上表面中（其中Transwell室包被基質(zhì)膠用于侵襲測定，無包被基質(zhì)膠用于遷移測定）；取600 μl含10%FBS的培養(yǎng)基加至下室。將細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，然后將轉(zhuǎn)移至Transwell上腔室的下表面的細胞用甲醇固定并結(jié)晶紫染色。在光學顯微鏡下，對6個隨機視野中染色的細胞計數(shù)。

1.2.5 Western blot實驗 RIPA緩沖液從組織或細胞中提取蛋白質(zhì)樣品，并用BCA蛋白定量試劑盒對提取的蛋白樣品定量。取等量的蛋白質(zhì)在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，并將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。室溫下，用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉膜2 h，加入一抗（DCLK1、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad7、Smad2和Smad7；均1:1 000稀釋）后孵育1.5 h；TBST洗膜后，室溫孵育二抗（1:2 000）1 h。用ECL化學發(fā)光法曝光目的蛋白條帶。β-actin作內(nèi)部對照，Image J軟件測定目的蛋白相對灰度值。

1.2.6 RT-qPCR實驗 TRIzol試劑提取組織和細胞標本的總RNA。使用NanoDrop 1000分光光度計（Thermo Scientific，美國）檢測RNA樣品的濃度。使用PrimeScript RT試劑盒通過反轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA。cDNA和引物通過SYBR Green PCR Master Mix試劑盒在7900 Real-time PCR System（Applied Biosystems，美國）中進行RT-qPCR反應。引物序列：DCLK1 F:5'-AGGCAGGTTACCATCACTGG-3'，R:5'-CATTGTTCTAGCTGCTCCCC-3'。GAPDH被用作內(nèi)部對照，其引物序列如下：GAPDH F:5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，R:5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。使用2-ΔΔCt方法計算DCLK1 mRNA的相對表達水平。

1.2.7 裸鼠腫瘤形成 8只6周齡SPF級雄性BALB/c裸小鼠（18～20 g）來源于長沙市天勤生物技術有限公司[SCXK（湘）2019-0014]，飼養(yǎng)于湖南省人民醫(yī)院SPF級動物房[SYXK（湘）2015-0013]。適應性飼養(yǎng)3天后，將已轉(zhuǎn)染sh-DCLK1或sh-Con的U87細胞（100 μl,1×107個/毫升）注射至頸部皮下，待可見瘤體（約100 mm3；游標卡尺測量，按照公式V=0.5×長×寬2計算）時，計為第0天，此后，每周測量一次瘤體體積，待第4周（28天）測量瘤體體積后麻醉并處死小鼠，收集瘤體并稱重。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，兩組之間比較采用t檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DCLK1在膠質(zhì)瘤細胞系U87和A172及膠質(zhì)瘤組織中的表達情況

RT-qPCR結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤組織中DCLK1 mRNA表達明顯高于癌旁組織（P=0.000），見圖1A，膠質(zhì)瘤細胞系U87和A172中DCLK1 mRNA均顯著高于正常神經(jīng)膠質(zhì)細胞HEB（P=0.000），見圖1B；免疫組織化學結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤組織中DCLK1呈彌漫陽性，見圖1C；Western blot結(jié)果表明，與癌旁組織相比，膠質(zhì)瘤組織中DCLK1蛋白表達明顯增加（P=0.000），見圖1D。

2.2 敲低DCLK1表達抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖

Western blot結(jié)果表明sh-DCLK1轉(zhuǎn)染的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87和A172中DCLK1蛋白表達均下調(diào)（P=0.000），見圖2A。MTT法檢測了sh-DCLK1轉(zhuǎn)染對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響，結(jié)果表明，敲低DCLK1表達可明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖（P=0.000），見圖2B。

2.3 敲低DCLK1表達抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲

Transwell結(jié)果顯示，與sh-Con組相比，敲除DCLK1的膠質(zhì)瘤U87和A172細胞遷移能力（P=0.003;P=0.006）和侵襲能力（P=0.005;P=0.002）均顯著降低，見圖3。

2.4 敲低DCLK1表達抑制U87細胞中TGF-β/Smads信號活性

Western blot結(jié)果表明，與sh-Con組相比，DCLK1敲除后的U87和A172細胞中TGF-β1蛋白表達、p-Smad2/Smad2和p-Smad7/Smad7比值均顯著降低（P=0.000），見圖4。

2.5 敲低DCLK1表達可抑制U87細胞在小鼠體內(nèi)的生長

圖1 DCLK1在膠質(zhì)瘤癌組織(A,C和D)和膠質(zhì)瘤細胞系(B)中表達升高Figure 1 DCLK1 expression were upregulated in glioma tissues(A,C and D) and cell lines(B)

圖2 敲低DCLK1表達(A)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖(B)Figure 2 Knockdown of DCLK1 expression(A) inhibited proliferation(B) of glioma cells

體積測量結(jié)果顯示，與sh-Con組相比，sh-DCLK1組瘤體體積明顯變?。≒=0.000），見圖5A；在第28天收集瘤體并稱重，結(jié)果顯示，sh-DCLK1組瘤體質(zhì)量明顯小于sh-Con組（P=0.000），見圖5B、5C。

3 討論

膠質(zhì)瘤約占原發(fā)性腦癌的80%[8]。大多數(shù)成人神經(jīng)膠質(zhì)瘤確診時已是中晚期，預后差[9]。探索膠質(zhì)瘤腫瘤進展的分子機制，有助于為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷和治療新策略的制定提供可行的靶點。

圖3 敲低DCLK1表達抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移(A)和侵襲(B) (×200)Figure 3 Knockdown of DCLK1 inhibited migration(A) a n d invasion(B) of glioma cells (×200)

圖4 敲低DCLK1表達抑制U87和A172細胞中TGF-β/Smads信號活性Figure 4 Knockdown of DCLK1 expression inhibited TGF-β/Smads signaling activity in U87 and A172 cells

圖5 敲低DCLK1表達可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤在小鼠體內(nèi)的生長Figure 5 Knockdown of DCLK1 expression could inhibit glioma growth in mice

DCLK1屬于神經(jīng)元微管相關雙皮質(zhì)素家族成員，既往研究[10]認為DCLK1在皮質(zhì)神經(jīng)元的徑向遷移和軸突生長等神經(jīng)發(fā)育的多個階段發(fā)揮重要作用。因DCLK1具有調(diào)節(jié)微管相關蛋白（microtubule associated proteins,MAPs）表達和驅(qū)動微管聚合的功能，而MAPs表達失調(diào)和微管聚合與癌癥的發(fā)生和進展密切相關[11]，故推測DCLK1可能在腫瘤的發(fā)生與進展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。近來研究[4-7,12]也證實了DCLK1與多種惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和不良預后有關，過表達DCLK1可促進這些腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移；抑制DCLK1表達可降低腫瘤細胞侵襲性及轉(zhuǎn)移能力。本研究發(fā)現(xiàn)，DCLK1在膠質(zhì)瘤組織和細胞中高表達，sh-DCLK1轉(zhuǎn)染沉默膠質(zhì)瘤細胞中DCLK1的表達能抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移與侵襲；此外，通過移植瘤模型證實了敲低DCLK1能在體內(nèi)抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長。結(jié)果提示，靶向抑制膠質(zhì)瘤細胞DCLK1的表達可能是潛在的抗膠質(zhì)瘤的有效策略。

TGF-β/Smads信號異常激活可促進包含膠質(zhì)瘤在內(nèi)等多種腫瘤細胞增殖和EMT[13-14]。EMT是腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的關鍵步驟之一，且其能賦予腫瘤細胞自我更新和遠端轉(zhuǎn)移的能力。有研究[15]顯示，檸檬酸桿菌可通過誘導TGF-β/Smads介導的EMT途徑促進DCLK1結(jié)腸隱窩細胞轉(zhuǎn)移至基質(zhì)并導致結(jié)腸腫瘤結(jié)節(jié)的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，敲低DCLK1能抑制U87和A172細胞中TGF-β/Smads信號通路的關鍵信號因子TGF-β1、p-Smad2和p-Smad7的表達，提示敲低DCLK1可導致膠質(zhì)瘤細胞中TGF-β/Smads信號活性降低。有研究[16-17]表明抑制TGF-β/Smads信號活性能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖、EMT、遷移與侵襲。因此，該結(jié)果提示，敲低DCLK1對膠質(zhì)瘤細胞增殖遷移與侵襲的抑制作用可能與其抑制TGF-β/Smads信號相關。

目前本研究有一定的局限性，如患者樣本量相對較小、未進一步探討DCLK1直接作用靶點、未研究DCLK1與其他基因之間的相互作用及可能在癌癥發(fā)展中發(fā)揮潛在作用的相對信號通路。膠質(zhì)瘤的進展由各種促癌基因、抑癌基因、非編碼RNA及各種信號途徑組成的復雜的網(wǎng)絡調(diào)節(jié)的過程。為解釋DCLK1對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進展的影響，需要進一步探索DCLK1參與的眾多神經(jīng)膠質(zhì)瘤的調(diào)控網(wǎng)絡。

綜上所述，DCLK1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)，而下調(diào)DCLK1表達可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲，以及小鼠移植瘤的生長，其機制可能是通過TGF-β/Smads信號通路參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展。