李 艷, 黃 萱, 肖 蘭, 張 英, 陳 潁, 石小燕

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首[1]。miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)約20～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。miRNA通過(guò)和靶基因mRNA堿基配對(duì)，促使靶mRNA降解或阻遏靶mRNA翻譯，已有研究[2]表明miRNA在增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥中發(fā)揮重要作用。miR-214位于人1號(hào)染色體，由Dicer酶將其環(huán)狀前體剪切形成miR-214-3p以及miR-214-5p，在多種癌癥中表達(dá)異常，可與多種癌基因及抑癌基因相互作用[3]。早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1(early growth response protein 1，EGR1)屬于早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因家族[4]，可對(duì)生長(zhǎng)因子的刺激做出快速反應(yīng)，該基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及腫瘤等疾病中均起著重要作用。該研究用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染上調(diào)/下調(diào)miR-214-3p在人卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞增殖、藥物敏感性及凋亡實(shí)驗(yàn)等探討miR-214-3p對(duì)人卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性影響，并分析EGR1作為其潛在靶點(diǎn)的可能。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑細(xì)胞株：人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株C13K及順鉑敏感株OV2008為本室保存。順鉑購(gòu)自山東齊魯制藥有限公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Annexin V-FITC試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司；SYBR Green Master Mix及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；EGR1鼠抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；著色性干皮病基因 (xeroderma pigmentosum，XPD)多克隆兔抗購(gòu)自美國(guó)CST公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；miR-214-3p mimics(模擬物)、miR-214-3p inhibitor(抑制劑)、negative control (NC)，U6及miR-214-3p莖環(huán)引物均購(gòu)自上海吉瑪公司，相關(guān)序列見(jiàn)表1；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton- Dickinson公司。

表1 miR-214-3p mimics、inhibitor、NC、EGR1及U6序列

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) C13K和OV2008細(xì)胞于含15%小牛血清1640培養(yǎng)液，5% CO2濃度、飽和濕度及37 ℃培養(yǎng)條件下孵育培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，棄上層培養(yǎng)液，C13K和OV2008細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-214-3p mimics(mimics組)、miR-214-3p inhibitor(inhibitor組)以及miR-214-3p negative control(NC組)試劑，未轉(zhuǎn)染OV2008及C13K細(xì)胞為空白對(duì)照組。細(xì)胞分組：OV2008空白對(duì)照組、OV2008 NC組、OV2008 inhibitor組、C13K空白對(duì)照組、C13K NC組及C13K mimics組；按說(shuō)明書(shū)將miR-214-3p mimics、inhibitor、mimics及inhibitor各自NC稀釋至20 μmol/L，4 ℃保存?zhèn)溆?。具體操作按Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。6 h后PBS沖洗2遍，更換培養(yǎng)基，每孔加入含15%小牛血清1640培養(yǎng)液2 ml繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率及順鉑IC50以1×104/ml細(xì)胞濃度鋪96孔板，每孔100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。IC50檢測(cè)：棄舊培養(yǎng)基，DDP(0～200 μmol/L)培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)基，加入10 μl的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)各孔細(xì)胞吸光度值(optical density, OD)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，抑制率 (%)= (1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率計(jì)算順鉑對(duì)細(xì)胞IC50。細(xì)胞增殖：DDP(60 μmol/L)培養(yǎng)24 h，加入10 μl的CCK-8，再培養(yǎng)4 h，450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔OD值。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 順鉑10 μmol/L及順鉑50 μmol/L分別作用于各組OV2008和C13K細(xì)胞，24 h后0.25%胰酶消化細(xì)胞，0.01 mol/L冰PBS 0.5 ml重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min去培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，去上清液，收集細(xì)胞。200 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫中避光孵育30 min，加入300 μl Binding Buffer，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Cell Quest軟件分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) RNA試劑盒提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以U6為內(nèi)參照，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。PCR反應(yīng)在ABI7300反應(yīng)平臺(tái)上進(jìn)行，以2-△△Ct法計(jì)算各組細(xì)胞中miR-214-3p及EGR1 mRNA相對(duì)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6免疫印跡 以GAPDH水平作為等量蛋白質(zhì)上樣對(duì)照，取50 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上；室溫封閉2 h，含0.05% Tween-20的TBS緩沖液(TBST)漂洗3次，每次10 min；加入相應(yīng)EGR1一抗(1 ∶1 000)及XPD一抗(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次后加入相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(1 ∶5 000)，37 ℃搖床溫育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色，凝膠分析系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 兩株卵巢癌細(xì)胞miR-214-3p相對(duì)表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR(圖1)顯示miR-214-3p在OV2008中表達(dá)顯著高于其順鉑耐藥細(xì)胞株C13K(F=267.915，P<0.001)；miR-214-3p相對(duì)量在OV2008 NC組和OV2008 inhibitor組表達(dá)分別為(10.6±1.87)和(0.33±0.16)，OV2008 inhibitor組與其空白對(duì)照組比較miR-214-3p相對(duì)量減少(F=79.517，P<0.001)；C13K NC組及C13K mimics組miR-214-3p相對(duì)量分別為(0.11±0.09)及(22.42±4.27)，C13K mimics組與其空白對(duì)照組比較miR-214-3p相對(duì)量增加(F=378.625，P<0.001)；兩株細(xì)胞NC組及空白對(duì)照組miR-214-3p差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.173，F(xiàn)=2.925，P>0.05)。

圖1 各組細(xì)胞miR-214-3p相對(duì)表達(dá)量

2.2 轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖率影響miR-214-3p inhibitor轉(zhuǎn)染后OV2008細(xì)胞增殖能力增加，與其空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.722，P<0.01)；miR-214-3p mimics轉(zhuǎn)染使C13K細(xì)胞增殖能力減弱，與其空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.825，P<0.01)，兩株細(xì)胞NC組及空白對(duì)照組增殖率變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.575，F(xiàn)=1.728，P>0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞增殖活性

2.3 轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞順鉑IC50影響順鉑IC50顯示，轉(zhuǎn)染miR-214-3p inhibitor抑制了OV2008中內(nèi)源性miR-214-3p表達(dá)，使順鉑對(duì)OV2008細(xì)胞殺傷減弱，與其空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.56，P<0.01)；轉(zhuǎn)染miR-214-3p mimics致C13K過(guò)表達(dá)miR-214-3p，使順鉑對(duì)C13K細(xì)胞殺傷增加，與其空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.751，P<0.01)，兩株細(xì)胞NC組及空白對(duì)照組IC50變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.876，F(xiàn)=1.993，P>0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞順鉑IC50

2.4 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡情況順鉑作用24 h，OV2008 inhibitor組細(xì)胞凋亡率為(5.6±1.5)%，C13K mimics組細(xì)胞凋亡率為(11.9±2.2)%，與兩株細(xì)胞各自空白對(duì)照組比較，凋亡率發(fā)生明顯改變(F=45.722，F(xiàn)=50.475，P<0.01)，見(jiàn)圖4。

2.5 轉(zhuǎn)染后EGR1基因表達(dá)改變OV2008空白對(duì)照組、OV2008 NC組、 OV2008 inhibitor組、C13K空白對(duì)照組、C13K NC組及C13K mimics組EGR1相對(duì)量分別為(0.84±0.16)、(1.06±0.12)、(0.21±0.10)、(0.15±0.09)、(0.22±0.17)和(3.12±0.87)；C13K mimics組與其空白對(duì)照組相比EGR1相對(duì)量增加(F=66.321，P<0.01)。OV2008 inhibitor組與其空白對(duì)照組相比EGR1相對(duì)量減少(F=112.429，P<0.01)。兩株細(xì)胞NC組及空白對(duì)照組EGR1水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.396，F(xiàn)=1.567，P>0.05)，見(jiàn)圖5。

圖4 各組細(xì)胞凋亡情況

圖5 各組細(xì)胞EGR1相對(duì)表達(dá)量

2.6 轉(zhuǎn)染后EGR1及XPD蛋白表達(dá)改變C13K NC組及空白對(duì)照組則為EGR1表達(dá)水平較低，XPD表達(dá)水平較高；OV2008 NC組及空白對(duì)照組EGR1表達(dá)水平較高，XPD表達(dá)水平較低。miR-214-3p mimics轉(zhuǎn)染使C13K中EGR1水平增加，XPD蛋白水平下降；miR-214-3p inhibitor轉(zhuǎn)染使OV2008中EGR1水平下降，XPD水平上升，見(jiàn)圖6。

圖6 各組細(xì)胞EGR1及XPD蛋白表達(dá)

3 討論

鉑類(lèi)藥物是目前治療卵巢癌一線化療藥物之一，但許多患者對(duì)鉑類(lèi)藥物發(fā)生耐藥常導(dǎo)致治療失敗，因此研究其耐藥相關(guān)因素及機(jī)制，尋找能夠有效逆轉(zhuǎn)耐藥的治療靶點(diǎn)意義重大。miRNAs是人體內(nèi)一類(lèi)非編碼雙鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，并且近年越來(lái)越多研究[5]表明miRNA的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的化療藥物耐藥有關(guān)。miR-214-3p是細(xì)胞內(nèi)重要的miRNA之一，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用[6-7]，目前卵巢癌相關(guān)研究主要集中于miR-214[8-9]，而有關(guān)miR-214-3p與卵巢癌順鉑耐藥的研究國(guó)內(nèi)外均尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究擬通過(guò)抑制及過(guò)表達(dá)miR-214-3p，了解miR-214-3p與卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥關(guān)系及其可能作用機(jī)制，從而為卵巢癌診斷和治療提供新的分子靶標(biāo)。研究顯示miR-214-3p在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞系C13K表達(dá)明顯低于其順鉑敏感細(xì)胞系OV2008，推測(cè)miR-214-3p可能參與卵巢癌細(xì)胞的順鉑耐藥。進(jìn)一步瞬時(shí)轉(zhuǎn)染證實(shí)過(guò)表達(dá)miR-214-3p可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，增加順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并部分恢復(fù)細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性；miR-214-3p拮抗劑則促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，抵抗順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性降低。

EGR1是一種鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，其在不同的組織中發(fā)揮不同的作用，即其既有促瘤作用又有抑瘤作用。許多研究[10]表明EGR-1在多種惡性腫瘤中表達(dá)缺失，而在卵巢癌組織中EGR1可促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展[11]。EGR1通過(guò)促進(jìn)乏氧誘導(dǎo)的自噬導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的化療耐受[12]；在肺癌耐藥細(xì)胞中PTEN和EGR1基因的表達(dá)均減少[13]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)卵巢癌中miR-152及EGR1低表達(dá)與卵巢癌順鉑耐藥有關(guān)[14]。miR-214-3p在卵巢癌中順鉑耐藥是否與EGR1有關(guān)尚不明確。著色性干皮病基因可編碼解螺旋，為核苷酸切除修復(fù)途徑的必需成分，是預(yù)測(cè)細(xì)胞順鉑敏感性重要指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示上調(diào)miR-214-3p后，細(xì)胞中EGR1升高，XPD表達(dá)降低；反之，隨著miR-214-3表達(dá)下調(diào)EGR1表達(dá)下降，XPD表達(dá)升高。說(shuō)明miR-214-3p對(duì)卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響機(jī)制與miR-214-3p調(diào)控EGR1表達(dá)有關(guān)。

綜上，miR-214-3p在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株C13K中低表達(dá)，上調(diào)(下調(diào))miR-214-3p表達(dá)能夠提高(降低)人卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑藥物敏感性。miR-214-3p可能通過(guò)作用于EGR1參與卵巢癌順鉑耐藥，本研究為卵巢癌順鉑耐藥的研究提供一條新的線索，其具體調(diào)控作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。