張威存，黃麗華

1.廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，廣州 510360；2.廣東省藥品檢驗所，廣州510663

小麥纖維素顆粒約含80%的纖維素，其中不可溶性纖維素占比≥90%，是一種不能消化的純天然纖維素制劑，顆粒直徑0.8～2.0 mm，并含有大量親水羥基，增加糞便體積的同時增加其水結(jié)合能力，使糞便的體積和質(zhì)量增大，促進腸蠕動功能，使得糞便排出更加順暢，是國家食品藥品監(jiān)督管理局批準的治療便秘的制劑［1-4］。

藥品微生物限度檢查是目前藥物安全的一個重要且有效的手段［5］，為了確保小麥纖維素顆粒微生物限度檢查法的準確性和可靠性，保證藥品的用藥安全，參照《中國藥典》2015 年版微生物限度檢查方法［6］，根據(jù)小麥纖維素顆粒理化特性和微生物限度標準等因素選擇適宜的計數(shù)方法和控制菌檢查，并對其進行微生物限度方法適用性試驗，建立微生物限度檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CL-40M 高壓滅菌器（日本ALP 株式會社）；GRX-12A 干熱消毒箱（上海森信實驗儀器有限公司）；LRH-250A 生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；MIR-254-PC 恒溫培養(yǎng)箱（松下健康醫(yī)療器械株式會社）；BS323S 電子天平（賽多利斯公司，萬分之一）。

1.2 樣品

小麥纖維素顆粒，深圳市永科醫(yī)藥有限公司提供（生產(chǎn)企業(yè)：Sweden Recipharm Hoganas AB 公司；批號：250301、250302、250303，規(guī)格：每包3.5 g）。

1.3 方法適用性菌種

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］，銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］，枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］，大腸埃希菌［CMCC（B）44102］，乙型副傷寒沙門菌 ［CMCC（B）50094］，白色念珠菌［CMCC（F）98001］，黑曲霉［CMCC（F）98003］，均由中國食品藥品檢定研究院提供，菌種均為第三代。

1.4 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（簡稱TSA，批號：180124）；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（簡稱TSB，批號：1073065）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（簡稱SDA，批號：171207）；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（簡稱SDB，批號：1071003）；pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：181029）；麥康凱液體培養(yǎng)基（批號：1075425）；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（簡稱MAC，批號：1076291）；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（簡稱NAC，170605）；氧化酶試紙（批號：6105168）；甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：170509）；RV 沙門增菌液體培養(yǎng)基（批號：1086061）；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（批號：180524）；三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（簡稱TSI，批號：1071771）。以上培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，按使用說明書配制，使用前進行培養(yǎng)基適用性檢查，均符合規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 計數(shù)方法適用性試驗與結(jié)果

2.1.1 菌液的制備分別將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種至TSB 中，置32 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至SDB 中，置23 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；將上述菌株培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)為不大于104 cfu 的菌懸液，備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至SDA 斜面培養(yǎng)基中，置23 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 后，加入含0.05%聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液5 mL，將孢子洗脫，收集孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每l mL 含孢子數(shù)為不大于104 cfu的孢子懸液，備用。

2.1.2 供試液的制備取本品10 g，加pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至200 mL，搖勻，靜置5 min，取上清液作為1∶20 的供試液。

2.1.3 需氧菌、霉菌和酵母菌檢查方法適用性試驗試驗組：分別取上述菌懸液0.1 mL，加至10.0 mL 供試液中，使各試驗菌每1 mL 含菌量不大于100 cfu，混勻。分別取混勻好的溶液1 mL 注入平皿中，立即傾注相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌組傾注TSA，白色念珠菌、黑曲霉組分別傾注TSA 和SDA 2 種培養(yǎng)基），每株試驗菌平行制備2 個平皿，待凝，TSA 倒置于32 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，SDA 倒置于23 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，觀察培養(yǎng)結(jié)果，以平均菌落數(shù)作為最終結(jié)果。

菌液對照組：取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，按試驗組方法操作加入試驗菌液，并進行微生物回收試驗。供試品對照組：取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗組操作。

2.1.4 方法適用性試驗結(jié)果小麥纖維素顆粒微生物計數(shù)結(jié)果見表1，從表中可以看出1∶20 供試液微生物檢查中，需氧菌，霉菌及酵母菌總數(shù)計數(shù)的回收比值均在0.5～2.0 范圍內(nèi)，且回收比值均在0.8以上，3 次均能重現(xiàn)試驗結(jié)果。故該計數(shù)方法適用于小麥纖維素顆粒的微生物檢查。

表1 小麥纖維素顆粒微生物計數(shù)方法試驗回收比值

2.2 控制菌檢查方法適用性試驗與結(jié)果

本品控制菌檢查包括有大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌。

2.2.1 菌液制備分別取大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌的新鮮培養(yǎng)物接種至TSB 培養(yǎng)基中，置32 ℃培養(yǎng)24 h；培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每mL 含菌數(shù)不大于102 cfu 的菌懸液，備用。

2.2.2 供試液的制備取本品10 g，加pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至200 mL，搖勻，靜置5 min，取上清液作為1∶20 的供試液

2.2.3 大腸埃希菌控制菌檢查法的適用性試驗陽性對照組：取上述1∶20 供試液20 mL 及每mL 含菌數(shù)不大于102 cfu 大腸埃希菌的菌液1 mL，加至200 mL TSB 中，32 ℃培養(yǎng)24 h 后，取培養(yǎng)物1 mL 接種至100 mL 麥康凱液體培養(yǎng)基中，43 ℃培養(yǎng)48 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于MAC 平板上，32 ℃培養(yǎng)72 h。

供試品對照組：取制備好的供試液，以pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，同陽性對照組方法操作。陰性對照組：取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，不加菌液，進行陰性對照組試驗。

2.2.4 銅綠假單胞菌控制菌檢查法的適用性試驗陽性對照組：取上述1∶20 供試液20 mL 及每mL 含菌數(shù)不大于102cfu 銅綠假單胞菌的菌懸液1 mL，加至200 mL TSB 中，32 ℃培養(yǎng)24 h 后，取培養(yǎng)物劃線接種于NAC 平板上，32 ℃培養(yǎng)72 h 后，取平板上生長的菌落進行氧化酶試驗（用玻棒挑起新鮮培養(yǎng)物于氧化酶試紙表面，觀察菌落顏色，陽性為紅色，陰性不變色）。

供試品對照組：取制備好的供試液，以pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，同試驗組方法操作。陰性對照組：取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，不加菌液，進行陰性對照組試驗。

2.2.5 金黃色葡萄球菌控制菌檢查法的適用性試驗陽性對照組：取上述1∶20 供試液20 mL 及每mL 含菌數(shù)不大于102cfu 金黃色葡萄球菌的菌懸液1 mL，加至200 mL TSB 中，32 ℃培養(yǎng)24 h 后，取培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，32℃培養(yǎng)72 h。

供試品對照組：取制備好的供試液，以pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，同試驗組方法操作。陰性對照組：取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，不加菌液，進行陰性對照組試驗。

2.2.6 乙型副傷寒沙門菌控制菌檢查法的適用性試驗陽性對照組：取供試品10 g 及每mL 含菌數(shù)不大于102cfu 乙型副傷寒沙門菌的菌懸液1 mL，加至200 mL TSB 中，32 ℃培養(yǎng)24 h 后，取培養(yǎng)物0.1 mL接種至10 mL RV 沙門增菌液體培養(yǎng)基中，32 ℃培養(yǎng)24 h。取少量RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，32 ℃培養(yǎng)48 h。若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上菌落生長良好，為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色時用接種針挑選疑似菌落于TSI 高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)24 h。

供試品對照組：取制備好的供試液，以pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，同試驗組方法操作。陰性對照組：取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，不加菌液，進行陰性對照組試驗。

2.2.7 控制菌檢查法的適用性試驗結(jié)果小麥纖維素顆粒的控制菌檢查結(jié)果見表2。由表可見3 個樣品的陽性對照組結(jié)果均為陽性，分別檢出大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌這4 種控制菌，而供試品對照組及陰性對照組均為陰性，未檢出相應(yīng)的控制菌。因此，小麥纖維素顆粒相應(yīng)的控制菌可以按照《中國藥典》2015 年版四部通則1106 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查［6］，該方法對小麥纖維素顆粒的控制菌檢查適用性試驗成立。

表2 小麥纖維素顆?？刂凭鷻z查法的適用性試驗結(jié)果

3 討論

藥品微生物限度檢查的操作步驟繁雜，結(jié)果受多方面的影響［7］。為確保檢查方法的準確性和完整性，首先要確認其計數(shù)方法適用性試驗與控制菌檢查方法適用性試驗，以保證供試品中被污染的微生物能被檢出，結(jié)果方屬有效。

在小麥纖維素顆粒微生物檢查時，采用1∶20的稀釋倍數(shù)是由于本品吸水性較強，1∶10 的供試液很粘稠，無法吸取，故制成1∶20 的供試液進行計數(shù)方法適用性試驗與控制菌檢查方法適用性試驗。值得注意的是，供試品稀釋后需靜置5 min，使其充分溶解于pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，再進行下一步試驗。研究結(jié)果顯示，計數(shù)方法試驗中各試驗菌回收比值均在0.5～2.0 范圍內(nèi)，且回收比值均在0.8 以上，說明該計數(shù)方法適用于小麥纖維素顆粒的需氧菌總數(shù)，霉菌及酵母菌的檢查。

小麥纖維素顆粒是從麥麩中提取的純天然纖維經(jīng)過一定的加工而制成口服給藥制劑，《中國藥典》2015 年版四部通則［6］規(guī)定口服制劑控制菌檢查中不得檢出大腸埃希菌，因其含有純天然的植物成分，每10 g 供試品中還不得檢出沙門菌。另外，原料藥小麥麥麩屬于藥食同源的植物，查閱相關(guān)食品質(zhì)量標準［8］發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌是常見的食源性致病菌，廣泛存在于自然環(huán)境中。它在適當?shù)臈l件下，能夠產(chǎn)生腸毒素，可引發(fā)食物中毒，化膿性感染及中毒性休克等癥狀［9］。值得注意的是小麥纖維素顆粒的生產(chǎn)工藝中也涉及到對銅綠假單胞菌的控制，銅綠假單胞菌是一種重要的革蘭陰性條件致病菌，可引發(fā)人體呼吸道、泌尿道、消化道皮膚軟組織及手術(shù)創(chuàng)面等多部位的急性或慢性感染［10］。基于金黃色葡萄球菌以及銅綠假單胞桿菌的致病性，為了更加嚴格控制小麥纖維素顆粒的微生物限度安全，其控制菌檢查中還不得檢出金黃色葡萄球菌以及銅綠假單胞桿菌。

4 結(jié)論

在對3 批樣品進行的微生物限度檢查方法適用性試驗中，需氧菌、霉菌和酵母菌的各試驗菌回收比值均在0.5～2.0 范圍內(nèi)，陽性對照組均檢出試驗菌，陰性對照組及供試品對照組均未檢出，該微生物限度檢查方法適用性成立。本文建立的方法適用于小麥纖維素顆粒的微生物限度檢查。