倪楊 史玉琴 楊軍軍 石磊 張倩 熊融

（1 北京市林業(yè)果樹科學研究院，北京 100093；2 北京市落葉果樹工程技術(shù)研究中心，北京 100093；3 北京市食用林產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督管理事務中心，北京 100029）

我國是蜂產(chǎn)品出口大國，總出口額中90%以上銷往美國、歐盟、日本等國。2002年以來，歐盟因為我國的抗生素殘留超標，禁止我國蜂蜜進入歐盟市場，極大地影響了我國蜂產(chǎn)品的出口，蜂產(chǎn)品中主要抗生素包括氯霉素類、四環(huán)素類、磺胺類、硝基呋喃類及其他抗生素[1,2]。

硝基呋喃類藥物主要包括呋喃唑酮（AOZ）、呋喃它酮（AMOZ）、呋喃西林（AHD）和呋喃妥因（SEM），是可以人工合成的廣譜抗生素，由于其價格低廉、抗菌效果好，被廣泛應用于畜禽、水產(chǎn)、蜂等動物傳染病的預防和治療，但由于硝基呋喃類藥物很不穩(wěn)定，在動物機體內(nèi)很容易生成代謝物，由于代謝物穩(wěn)定且有致癌致畸作用，歐盟將其列為A類禁用藥物，并于1995年禁止在食用動物中使用[3]，我國也頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令[4]。目前，硝基呋喃類藥物是國際動物源性食品貿(mào)易的必檢項目。

近年來，硝基呋喃類代謝物的檢測方法主要有ELISA[5]、免疫膠體金法[6]、酶聯(lián)免疫技術(shù)[7]、同位素稀釋質(zhì)譜法[8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)[9]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定法[11]。酶聯(lián)免疫法和膠體金免疫法具有快速、簡便、靈敏、高特異性等優(yōu)點，但無法進行定量檢測，同時存在出現(xiàn)假陽性或假陰性風險。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法特異性更強，靈敏度和精確度更高，檢測限更低，但樣品前處理過程復雜，耗時長。QuEChERS方法步驟少，目標化合物損失少，試劑消耗少，經(jīng)濟環(huán)?？焖俑咝?，本研究目的是利用QuEChERS凈化方法，結(jié)合UPLC-MS/MS，通過優(yōu)化前處理以及色譜質(zhì)譜條件，建立簡便、高效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜、蜂王漿，市購。

4種硝基呋喃類代謝物標準品：3-氨基-2-噁唑酮（AOZ 80-65-9）、5-嗎啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（AMOZ 43056-63-9），德國Witega公司；1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD 2827-56-7）、氨基脲（SEM 563-41-7），德國Dr.Ehrenstorfer公司。

乙腈（色譜純），美國Fisher公司；乙酸乙酯、甲酸、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純），北京化工廠；2-硝基苯甲醛（優(yōu)級純），上海麥克林生化科技有限公司；Waters凈化管，美國Waters公司；微孔過濾膜（13mm×0.22μm，尼龍），迪馬科技有限公司；Acquity BEH C18（2.1×100mm，1.7μm），美國Waters公司；實驗用水為Milli-Q制備的超純水。

1.2 儀器與設備

Waters Xevo TO-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Waters公司；Milli-Q超純水儀（電阻率＞18.2MΩ·cm），美國Millipore公司；GL-20G-II高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；FE20型實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ZD-85氣浴恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；QL-8BB旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PL2002電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

稱取2.00g蜂蜜樣品、0.5g蜂王漿樣品（精確至0.01g），分別置于50ml棕色旋蓋離心管中，加入5ml 0.2mol/l鹽酸和0.3ml 0.1mol/l 2-硝基苯甲醛，高速振蕩30min，然后將離心管放入60℃水浴中反應30min，取出后冷卻至室溫。向離心管中加入10ml乙腈，渦旋1min，加入4g氯化鈉，渦旋振蕩1min后靜置分層。吸取5.0ml上層乙腈加入到Waters凈化管中，渦旋振蕩1min后靜置5min，過0.22μm有機濾膜，上機測定。

1.3.2 標準溶液的配制

標準儲備液的配制：準確稱取4種硝基呋喃類代謝物標準品各10.0mg，用甲醇分別溶解并定容至10ml棕色容量瓶中，配制成1.0mg/ml的單標儲備液。-18℃密封、避光保存，保質(zhì)期6個月。

混合標準儲備液的配制：準確吸取單標儲備液各1.0ml混合于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，配制成10.0μg/ml的混合標準儲備液。4℃避光保存，保質(zhì)期1個月。

基質(zhì)標準溶液的配制：對蜂蜜和蜂王漿樣品按照1.3.1預處理后進行儀器分析，當4種硝基呋喃類代謝物的定性與定量離子信噪比＜3時，該樣品確定為空白基質(zhì)。稱取6份蜂蜜、蜂王漿空白基質(zhì)于50ml棕色離心管中，分別加入適量混標儲備液，按照1.3.1操作步驟進行樣品預處理，配制成濃度分別為1.0ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的基質(zhì)標準溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 超高效液相色譜條件

色譜柱：Acquity BEH C18（2.1×100mm，1.7μm）；柱溫：40℃；流速：0.2ml/min；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸-水溶液；梯度洗脫程序：0～0.5min、90% B、Curve 5，0.5～1.0min、90%～40%B、Curve 5，1.0～3.0min、40%～10% B、Curve 6，3.0～4.0min、10% B、Curve 6，4.0～4.5min、90% B、Curve 3；進樣量：2μl。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI+）；毛細管電壓：2.5kV；離子源溫度：150℃；錐孔電壓：40V；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流量：650l/h；碰撞氣：氬氣（純度大于99.9%）；采集模式：多反應監(jiān)測（MRM）。目標物的定性定量離子對、裂解電壓、碰撞能量的優(yōu)化參數(shù)詳見表1。

表1 4種硝基呋喃類代謝物質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 衍生時間與溫度的選擇

如圖1所示，隨著衍生溫度的增加，衍生化反應迅速，衍生效率提高。隨著時間的延長，衍生物呈下降趨勢。衍生時間1h后，響應值逐漸降低，當溫度達到70℃時，AMOZ響應值略增高，而其他3種物質(zhì)與60℃衍生無差異，綜合考慮確定衍生溫度為60℃，時間為30min，衍生產(chǎn)物生成相對穩(wěn)定，衍生效果最好。

圖1 不同衍生時間、衍生溫度下4種硝基呋喃類代謝物含量變化

2.1.2 提取及凈化過程的優(yōu)化

本方法采用的是乙腈作為萃取溶劑，乙腈極性較大，提取能力較強，經(jīng)過鹽析后使得乙腈相與水相分層。實驗中發(fā)現(xiàn)，采用乙腈作為萃取劑時，當調(diào)節(jié)pH值7.5時，乙腈層產(chǎn)生增稠現(xiàn)象。采用不調(diào)節(jié)pH，結(jié)合QuEChERS法凈化直接進樣，以添加10.0μg/kg標準溶液為例，本方法與國標方法進行對比，結(jié)果見表2。

表2 方法對比

2.2 質(zhì)譜測定條件的優(yōu)化

采用ESI離子源直接進樣方式，配制濃度為100ng/ml的4種硝基呋喃類代謝物衍生后的標準溶液注入到離子源中，對母離子[M+H]+質(zhì)量數(shù)5-嗎啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（m/z 335.1）、1-氨基-1-乙酰脲（m/z 249.1）、3-氨基-2-噁唑酮（m/z 236.1）、氨基脲（m/z 209.1），進行二級碎片掃描。選擇穩(wěn)定性、豐度高的兩個碎片離子作為子離子，然后分別優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量，選擇最佳質(zhì)譜條件。

2.3 色譜測定條件的優(yōu)化

色譜條件直接影響目標組分的離子化效率和峰形，流動相多以乙腈、甲醇、水為流動相，針對化合物結(jié)構(gòu)特性可加入適當濃度的甲酸和乙酸銨。由于甲醇增強了泵的壓力，故本法忽略甲醇。采用乙腈-水、乙腈-水（含0.1%甲酸）、乙腈-水（含5mmol/l乙酸銨）和乙腈-水（含5mmol/l乙酸銨、0.1%甲酸）流動相體系優(yōu)化。一般為了提高離子化效率，改善峰形，正離子選用甲酸，負離子選擇乙酸銨作為調(diào)節(jié)流動相pH試劑。在梯度洗脫條件下，采集時間6min，流速0.2ml/min，柱溫40℃條件下，發(fā)現(xiàn)乙腈-水（含0.1%甲酸）作為流動相使目標物離子化提高，峰形尖銳。在MRM模式下測定，蜂蜜、蜂王漿基質(zhì)中添加100ng/ml的4種硝基呋喃類代謝物混合表樣的色譜圖，見圖2。

圖2 蜂蜜、蜂王漿空白基質(zhì)添加4種硝基呋喃類代謝物多反應監(jiān)測色譜圖

2.4 色譜柱的選擇

尋找一根高分離度且耐受性好的色譜柱，是開發(fā)方法的首要條件之一。本文選用BEH C18、HILIC和HSS T33種不同型號的柱子。BEH C18色譜柱采用第二代雜化顆粒技術(shù)，具有良好的保留能力和分離效率以及寬帶pH（1～12）使用范圍，并且具有極好的穩(wěn)定性和超長的使用壽命。

由于HILIC色譜柱為親水色譜柱，分離基于多模式混合保留機制，分析物的帶電狀態(tài)、色譜填料以及緩沖液濃度和流動相pH值，都對HILIC保留效果發(fā)揮作用，高比例的有機相易揮發(fā)，從而提高離子化效應和質(zhì)譜響應。HSS T3色譜柱其實是100%水性兼容的C18色譜柱，用來保留和分離極性水溶性的有機小分子，特別適用于反相色譜分離中增強對極性化合物和代謝物的保留。這3種色譜柱的性能和分離都可很好的分離硝基呋喃類代謝物質(zhì)，從使用的耐用性和價格方面考慮，故選用BEH C18色譜柱。

2.5 線性范圍和檢出限

按照樣品操作步驟同步操作濃度為1.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml、50.0ng/ml、100.0ng/ml的陰性樣品基質(zhì)標準溶液，具有良好的響應和線性關系（R＞0.999）。

2.6 回收率和精密度

本方法采用外標法定量，選用陰性蜂蜜及蜂王漿樣品進行添加回收和精密度實驗。在兩個樣品中分別進行添加，添加濃度均為1.0、10.0和100.0μg/kg，混勻后靜置，使標準溶液被樣品充分吸收，然后測定，每個添加水平平行測定6次，計算加標回收率范圍和相對標準偏差（RSD），結(jié)果詳見表4。

表3 標準曲線方程及檢出限

表4 硝基呋喃類代謝物回收率和相對標準偏差（n=6）

3 結(jié)論

本研究利用QuEChERS凈化方法結(jié)合超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了蜂蜜、蜂王漿中硝基呋喃類代謝物的檢測方法，優(yōu)化了前處理方法及色譜質(zhì)譜條件，獲得了滿意的分離效果和檢測靈敏度，其回收率、精密度和檢出限均滿足殘留分析的要求。用最終建立的分析方法進行添加回收實驗，并與國標進行比對，結(jié)果表明本方法有效提高了回收率，可以作為蜂蜜、蜂王漿中硝基呋喃類代謝物殘留的分析方法，能夠滿足日常檢測的需要。

本方法重復性好，準確度高，且操作簡單，大大簡化了前處理過程，對于批量化檢測具有明顯優(yōu)勢。