顧燕英，吳蓓穎，林 琳，蔡 剛#，顧鳴敏

1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025；2. 上海交通大學基礎醫(yī)學院基礎醫(yī)學實驗教學中心，上海 200025

珠蛋白生成障礙性貧血是由于珠蛋白基因發(fā)生突變或缺失導致珠蛋白生成障礙而引起的遺傳性溶血性貧血，臨床上以α 和β 珠蛋白生成障礙性貧血最為常見。其中，α 珠蛋白生成障礙性貧血主要分為缺失型和非缺失型 2 類，以東南亞缺失（--sea）、右向缺失（-α3.7）和左向缺失（-α4.2）為主，且該3 種缺失類型約占廣東省α 珠蛋白生成障礙性貧血的96%[1-2]。目前，多數(shù)臨床采用常用的商品化診斷試劑盒即跨越斷裂點聚合酶鏈反應（gap-polymerase chain reaction，Gap-PCR）法檢測上述3 種常見的基因缺失，而該方法對于罕見的α 珠蛋白基因缺失則易產(chǎn)生漏檢或誤檢。本研究就4 238 例患者先行常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測、再行Gap-PCR 和Sanger 測序法，對異常-α3.7條帶的樣本做進一步檢測并行家系分析，以期為臨床提供更準確的基因診斷結(jié)果及遺傳咨詢。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2016 年6 月—2019 年9 月于上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院兒科、血液科和婦產(chǎn)科就診的行常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測的患者4 238 例，其中男性1 491 例、女性2 747 例，年齡1 d ～95 歲。

本研究經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會批準[審批號：（2019）臨倫審第（54）號]，所有研究對象或監(jiān)護人均簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 血常規(guī)檢查 抽取患者靜脈血3 mL，以乙二胺四乙酸二鉀（dipotassium ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA-K2）抗凝。隨后，采用XS-800i 全自動血液分析儀（Sysmex，日本）對患者各項紅細胞參數(shù)進行檢測，包括紅細胞平均體積（mean corpuscular volume，MCV）、 紅細胞平均血紅蛋白量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）等。上述參數(shù)的參考區(qū)間參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程（第3 版）》，即MCV 正常參考區(qū)間為男（83.9 ～99.1）fL、 女（82.6 ～99.1）fL，MCH 正常參考區(qū)間為男（27.8 ～ 33.8）pg、女（26.9 ～33.3）pg，Hb 正常參考區(qū)間為男（131 ～172）g/L、女（113 ～151）g/L。

1.2.2 基因組DNA 提取 采用基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]對EDTA-K2 抗凝血行DNA 提取，方法依據(jù)說明書步驟進行。

1.2.3 常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測 采用Gap-PCR 法檢測α 珠蛋白基因3 種常見的缺失（--sea、-α3.7和-α4.2）。采用反向斑點雜交法（reverse dot blot，RDB）檢測3 種常見的非缺失α 珠蛋白基因點突變[分別為αWestmeadα（αWS）、αQuongSzeα（αQS）和αConstantSpringα（αCS）] 和17種β 珠蛋白基因突變[分別為CD41-42（-TTCT），IVS-Ⅱ-654（C →T），-28（A →G），CD17（AAG →TAG），CD71-72（+A），βE（GAG →AAG），-29（A →G），CD43（GAG →TAG），CD27/28（+C），CD14-15（+G），CD31（-C），-32（C →A），-30（T →C），IVS-Ⅰ-1（G →T），IVS- Ⅰ-5（G →C），5'UTR; +43-40（-AAAC），initiation condon（ATG →AGG）]?；蛟\斷試劑由亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司提供，并按照試劑說明書進行操作及結(jié)果判讀。

1.2.4 罕見型珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測 選擇異常-α3.7缺失條帶的樣本，即常規(guī)Gap-PCR 法檢測缺失型α 珠蛋白生成障礙性貧血時擴增出-α3.7條帶（弱條帶）及αα 條帶，或同時擴增出-α3.7條帶、αα 條帶及--sea條帶，送至亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司進行罕見型珠蛋白生成障礙性貧血檢測。該檢測方法采用Gap-PCR 法通過特異引物進一步檢測X1/X2 融合片段及αααanti4.2片段，判斷是否為香港型α 珠蛋白生成障礙性貧血基因（Hong Kong αα，HKαα）；若檢測結(jié)果為陰性，則采用Sanger 測序法行α1、α2 基因測序，并在HbVar 數(shù)據(jù)庫（http://globin.bx.psu.edu/hbvar）中查找測序結(jié)果的突變位點。

1.2.5 家系分析 珠蛋白生成障礙性貧血是一種常染色體隱性遺傳的單基因遺傳病，遺傳方式符合孟德爾定律。本研究根據(jù)孟德爾分離定律和自由組合定律（子代的2 個等位基因分別來自父親與母親，即只有父親或母親攜帶HKαα 與-α3.7基因，子代才可能出現(xiàn)HKαα/-α3.7基因型），對2 個家系的基因型進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用Excel 2016 及SAS 8.2 軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料以x—±s 表示，符合非正態(tài)分布的定量資料以M（Q1，Q3）表示。定性資料以百分率表示。在不同基因類型的血常規(guī)參數(shù)中，以Hb 取自然對數(shù)后（為正態(tài)分布）行單因素方差分析，基因型間比較采用獨立樣本t 檢驗；MCV 和MCH（為非正態(tài)分布）采用多獨立樣本的秩和檢驗?；蛐烷g比較采用兩獨立樣本的秩和檢驗。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測結(jié)果

采用Gap-PCR 和RDB 法對常見珠蛋白生成障礙性貧血基因突變和缺失進行檢測，結(jié)果（表1、圖1）顯示，在4 238 例患者中共檢出-α3.7缺失條帶者109 例，其基因型被初步判斷為88 例-α3.7/αα、19 例-α3.7/αα 復合β 珠蛋白生成障礙性貧血、1 例-α3.7/αQS，及1 例-α3.7、αα、--sea3 條帶（未確定）；同時在檢出的109 例中，有14 例-α3.7條帶較αα 條帶細弱，有1 例同時出現(xiàn)-α3.7、αα、--sea3 個條帶，因此將該15 例用于罕見型α 珠蛋白生成障礙性貧血基因的檢測。

表1 109 例-α3.7 缺失條帶患者中珠蛋白生成障礙性貧血患者的基因診斷結(jié)果及檢出率Tab 1 Genetic diagnosis results and detection rate of common mutations of thalassemia in 109 cases with -α3.7 deletion bands

圖1 Gap-PCR 法檢測結(jié)果的電泳圖 Fig 1 Electrophoretogram of Gap-PCR results

2.2 罕見型α 珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測結(jié)果

將上述14 例出現(xiàn)-α3.7弱條帶和1 例同時出現(xiàn)-α3.7、αα、--sea3 個條帶的樣本（共計15 例）送至亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司進行罕見型α 珠蛋白生成障礙性貧血檢測，即采用Gap-PCR 檢測HKαα 基因及Sanger 測序法進行α1、α2 基因測序。結(jié)果（表2）顯示，有13例為HKαα/αα 或HKαα/-α3.7，1 例為HKαα/--sea，1 例為NG_000006.1:g.34569_38382 del 3 812 bp 罕見缺失；且經(jīng)與HbVar 數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，該罕見缺失尚未記錄。通過進一步的Gap-PCR 和Sanger 測序法檢測，罕見型α 珠蛋白生成障礙性貧血基因的總誤檢率為0.35%（15/4 238），在-α3.7缺失中誤檢率為13.76%（15/109）；HKαα 基因的總檢出率為0.33%（14/4 238），在-α3.7缺失中誤檢率為12.84%（14/109）。

表2 15 例罕見型α 珠蛋白生成障礙性貧血患者的基因檢測結(jié)果Tab 2 Gene detection results of 15 patients with rare α-thalassemia

2.3 HKαα 的家系分析

由于采用Gap-PCR 法檢測HKαα 基因未能區(qū)分HKαα/αα 或HKαα/-α3.7等基因型，且本研究中存在2 個HKαα 的家系（家系1 來自上海、家系2 來自甘肅），因此可通過家系分析進一步區(qū)分其基因型。結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，家系2 中母親和孩子的基因型確定為HKαα/αα，但家系1 中父親和家系2 中外婆的基因型仍不能區(qū)分。

表3 2 個HKαα 家系的基因型分析Tab 3 Genotype analysis of two HKαα families

2.4 不同α 珠蛋白生成障礙性貧血基因類型的血常規(guī)參數(shù)比較

通過對不同類型的α 珠蛋白生成障礙性貧血患者進行血常規(guī)檢查與統(tǒng)計分析，結(jié)果（表4）顯示，HKαα/αα 或HKαα/-α3.7基因型的MCV 和MCH 水平高于-α3.7/αα 基因型（P=0.031，P=0.007），而Hb 水平間差異則無統(tǒng)計學意義；NG_000006.1:g.34569_38382 del 3 812bp 基因型的MCV、MCH 和Hb 水平分別為76.7 fL、24.6 pg 和139.0 g/L， 其中Hb 水平在正常參考區(qū)間內(nèi)，而MCV、MCH 水平較HKαα/αα or HKαα/-α3.7基因型有所下降。

表4 不同類型的α 珠蛋白生成障礙性貧血患者的血常規(guī)參數(shù)比較Tab 4 Comparison of blood routine parameters from the patients with different types of α-thalassemia

3 討論

α 珠蛋白生成障礙性貧血是由于α 珠蛋白基因缺陷導致α 珠蛋白肽鏈合成受到部分或完全抑制所致。α 珠蛋白基因簇位于16 號染色體16p13.3 位點，其基因在基因簇上的排列順序為5'-ζ-Ψζ-Ψα2-Ψα1-α2-α1-θ-3'。該基因簇包括2 個高度同源的基因，即α 1和α 2，在減數(shù)分裂時同源染色體發(fā)生錯配和不等交換則會產(chǎn)生-α3.7缺失型和對側(cè)重復αααanti3.7三聯(lián)體，或-α4.2缺失型和對側(cè)重復αααanti4.2三聯(lián)體等[3-4]。目前，臨床上常用的Gap-PCR 法可同時檢測α 珠蛋白的3 種常見缺失（即--sea、-α3.7和-α4.2），但對于罕見的缺失型易漏檢或誤檢。

本研究通過對4 238 例患者行常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測發(fā)現(xiàn)，15 例樣本出現(xiàn)了異常-α3.7缺失條帶，通過進一步行Gap-PCR 法檢測發(fā)現(xiàn)14 例為HKαα 基因。HKαα 是一種罕見的α 珠蛋白生成障礙性貧血基因，是由α 珠蛋白基因簇的重組和不等交換形成的含有-α3.7和αααanti4.2片段的重組基因，包含一個正常的α2 基因、一個由α1 與α2 形成的融合基因（-α3.7缺失基因片段）和一個由X1 與X2 形成的融合基因[5]，因此HKαα 基因用Gap-PCR 法能夠擴增出正常的αα 條帶和-α3.7缺失條帶。本研究發(fā)現(xiàn)HKαα 基因型能夠擴增出-α3.7缺失條帶，但是相比αα 條帶較為細弱，而-α3.7/αα 基因型的正常αα 條帶和-α3.7缺失條帶的亮度、粗細基本一致；繼而猜測，可能是由于HKαα 基因包含正常的α2 基因與-α3.7基因片段，而-α3.7缺失基因只含有-α3.7基因片段，兩者的-α3.7缺失基因和正常αα 基因的拷貝數(shù)不同，導致擴增產(chǎn)物的量亦不同，因此電泳結(jié)果中-α3.7與αα 條帶的亮度及粗細均存在差異。因此，經(jīng)Gap-PCR 法獲得的-α3.7/αα 電泳條帶，其可能是-α3.7/αα、HKαα/αα 或者HKαα/-α3.7，應在臨床工作中加以重視。另外，針對同時出現(xiàn)-α3.7、αα、--sea3 個條帶的異常結(jié)果，臨床上也應考慮其是否為HKαα 基因型，以避免誤檢或漏檢。

本研究發(fā)現(xiàn)，11 例HKαα/αα 或HKαα/-α3.7基因型患者的MCV 和MCH 均高于-α3.7/αα 基因型，與文獻[6-9]報道結(jié)果一致，但2 種基因型的Hb 水平間差異無統(tǒng)計學意義；本研究還發(fā)現(xiàn)，MCV 與MCH 參數(shù)對于不同類型的α 珠蛋白生成障礙性貧血的區(qū)分相較于Hb 更敏感，可能與貧血時紅細胞代償性增多而使Hb 水平增加有關(guān)；同時，在本研究中1 例HKαα/--sea患兒為6 周，其Hb 為100 g/L， MCV 和MCH 介于--sea/αα 基因型與-α3.7/--sea基因型，但由于HKαα/--sea基因型只有1 例且年齡較小，其血常規(guī)參數(shù)難以與--sea/αα 與-α3.7/--sea進行比較。有文獻[9-10]報道HKαα/--sea臨床癥狀明顯輕于-α3.7/--sea，若夫妻雙方分別攜帶HKαα 和--sea，該家庭則可選擇保住胎兒，以減輕家庭的經(jīng)濟與心理負擔。因此，避免將HKαα/--sea誤診為-α3.7/--sea， 將有助于提供正確的產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢。

目前有關(guān)于HKαα 的報道主要集中在兩廣地區(qū)，廣西地區(qū)人群中HKαα 的攜帶率為0.07%[6]，廣東地區(qū)的-α3.7攜帶者中HKαα 的檢出率為2.27%，且其在人群中的攜帶率為0.07%[11]。同時，也有文獻[8]對福建省進行研究顯示HKαα 在福建籍人群中的檢出率為0.36%，在-α3.7攜帶者中的檢出率為7.27%。陳文璟等[9]對-α3.7/αα 樣本進行檢測發(fā)現(xiàn)，HKαα 漏診率為16%。本研究共檢出HKαα 基因14 例，總檢出率為0.33%，在-α3.7攜帶者中檢出率為12.84%；且2 個家系分別來自甘肅和上海，均為珠蛋白生成障礙性貧血的非高發(fā)地區(qū)。本實驗檢出的HKαα 基因比例較高，有助于增加臨床對HKαα 基因的認識，從而進行更準確的遺傳咨詢。

目前，檢測HKαα 基因的方法有巢式PCR 技術(shù)、Southern 印跡雜交、測序技術(shù)等，其中以兩輪巢式PCR方法最為多見[7-10]，可以對HKαα 基因型進行診斷。本實驗采用Gap-PCR 法通過特異性引物分別檢測X1/X2 融合片段（HKαα 和αααanti4.2都包含此片段）及αααanti4.2片段（αααanti4.2特異性存在），但結(jié)果并未能區(qū)分HKαα/αα 或HKαα/-α3.7，因此還需通過家系分析來進行確定。

在由Gap-PCR 檢測的15 例異常-α3.7條帶中，1 例為HKαα 基因型陰性，經(jīng)進一步測序發(fā)現(xiàn)其α 珠蛋白基因序列為NG_000006.1:g.34569_38382 del 3 812 bp，該缺失在HbVar 數(shù)據(jù)庫上尚未見記錄。其中-α3.7細弱條帶的產(chǎn)生，可能是由于該缺失與-α3.7（NG_000006.1:g.34164_37967 del 3 804 bp）的缺失片段近，且在引物設計時-α3.7缺失的上下游引物間的缺失片段不同，導致擴增效率降低所致；同時，該條帶比HKαα 基因型的相應條帶更為細弱，因此在臨床工作中可能會被誤診為-α3.7/αα 或αα/αα，需引起重視。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)該病例的Hb 水平在正常參考區(qū)間內(nèi)，MCV、MCH 水平低于HKαα/αα or HKαα/-α3.7基因型，或可通過MCV 和MCH 進行簡單的區(qū)分。綜上，我們發(fā)現(xiàn)并非出現(xiàn)細弱-α3.7條帶的基因型都是HKαα 基因型；因此在臨床檢測中，當出現(xiàn)異常-α3.7條帶時建議醫(yī)師先進行HKαα 基因檢測，如果為陰性可再行α 珠蛋白基因測序，以減少錯檢與漏檢。

目前，臨床所用的檢測技術(shù)涵蓋了絕大部分的珠蛋白生成障礙性貧血類型，除血常規(guī)與常規(guī)基因檢測外，血紅蛋白毛細管電泳分析技術(shù)也是當前該貧血篩查的技術(shù)之一，且方法簡單易行，對于罕見類型具有良好的提示作用[12]。因此，在臨床工作中醫(yī)師可通過聯(lián)合檢測以及經(jīng)驗的積累來減少對罕見型珠蛋白生成障礙性貧血的誤檢和漏檢。本研究總結(jié)了臨床常規(guī)檢測中發(fā)現(xiàn)的異常-α3.7缺失條帶的罕見類型和特征，但由于珠蛋白基因的復雜性和方法的局限性使得某些結(jié)果的解釋存在不足。隨著今后基因檢測水平的增加和臨床檢測經(jīng)驗的累積，如何在常規(guī)檢測工作中減少漏檢與誤檢將有待更進一步的深入研究。

參·考·文·獻

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