蔣毅弘，廖 宇，岳 江，黃 融，劉 偉

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院內分泌代謝科，上海200127

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種復雜的內分泌代謝性疾病，在育齡期女性中的患病率為4%～10%[1]。PCOS 的主要臨床表現(xiàn)為稀發(fā)排卵或不排卵、高雄激素血癥和卵巢多囊樣變[2-3]。PCOS 女性患者除了生育能力降低，還通常合并肥胖、胰島素抵抗、糖脂代謝異常和心血管疾病[3-4]。

卵泡液由顆粒細胞、卵泡膜細胞和卵母細胞的分泌物以及血漿蛋白通過卵泡膜毛細血管基膜擴散組成，主要成分為蛋白質、類固醇激素、多糖和代謝物等[5]。卵泡液為卵母細胞的發(fā)育提供了微環(huán)境，并對卵泡發(fā)育過程中卵子和卵泡細胞的通訊起到媒介作用。卵泡液蛋白質成分的改變可以反映出病理狀態(tài)下卵泡細胞分泌過程和血漿組分的變化[6]。

近年來，蛋白質組學的興起對PCOS 的發(fā)病機制、生物標志物、藥物治療靶點和預防遠期并發(fā)癥提供了新的見解。與傳統(tǒng)的蛋白質組學技術如雙向凝膠電泳和質譜分析相比，蛋白抗體芯片技術具有高通量、快捷、高靈敏度等特點[7-8]。目前，關于PCOS 患者卵泡液的蛋白質組學研究甚少。本研究采用AAH-BLG-507 蛋白芯片，對PCOS 患者和非PCOS 患者卵泡液標本進行檢測，篩選差異表達蛋白，并對差異蛋白進行生物信息學分析，以期為PCOS 的診斷以及發(fā)病機制和遠期并發(fā)癥的研究提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

PCOS 組納入于上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院生殖中心就診的擬行體外受精/卵胞質內單精子顯微注射-胚胎移植助孕的6 例正常體質量指數(shù)（body mass index，BMI）PCOS 患者，平均年齡（30.67±3.67）歲，BMI（23.12±2.77）kg/m2，胰島素抵抗指數(shù)（HOMAIR）為1.84±0.38；以6 例年齡、BMI 匹配的非PCOS 女性患者為對照組，平均年齡（30.00±2.83）歲，BMI（21.84±2.15）kg/m2，HOMA-IR 為1.27±0.37。

PCOS 組患者診斷采用2003 年鹿特丹標準（以下3項中滿足2 項及以上即診斷為PCOS）[2]：①月經(jīng)稀發(fā)或無排卵。②有高雄激素的臨床表現(xiàn)和/或高雄激素血癥。③B 超檢查見一側或雙側卵巢直徑2 ～9 mm 的卵泡≥12個和/或一側卵巢體積≥10 cm3。同時，排除先天性腎上腺皮質增生、分泌雄激素的腫瘤、庫欣綜合征、甲狀腺功能異常、高泌乳素血癥、2 型糖尿病等其他疾病。

對照組納入年齡、BMI 匹配的女性患者，因輸卵管原因或男方原因導致不孕，排除其他內分泌疾病（甲狀腺功能異常、高泌乳素血癥等），且近6 個月內未使用免疫調節(jié)、細胞毒性、細胞因子及激素類藥物。

本研究得到醫(yī)院倫理委員會的批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 蛋白芯片和儀器

Raybiotech 試劑盒（RayBio Biotin Label-based Human Array 1，AAH-BLG-507 芯片；Raybiotech 公司，美國），由上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司協(xié)助完成操作；芯片掃描儀（GenePix 4000B，Axon 公司，美國）；GenePix Pro 6.0 軟件（Axon 公司，美國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 卵泡液收集 采用標準促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）拮抗劑促排卵方案：月經(jīng)周期第3 天起予以重組人促卵泡素，當至少有1 個卵泡的直徑≥12 mm 時予以皮下注射GnRH 拮抗劑250 μg/d 直至卵泡發(fā)育成熟。當至少有1 個優(yōu)勢卵泡直徑≥18 mm時予以肌內注射人絨毛膜促性腺激素4 000 ～8 000 IU，36 h 后經(jīng)陰道超聲引導下穿刺取卵。收集未被血液污染的優(yōu)勢卵泡液，室溫400×g 離心5 min，收集上清液并于-80 ℃冰箱凍存。

1.3.2 蛋白芯片檢測方法 所有實驗操作均嚴格按照Raybiotech 試劑盒說明書的標準操作流程進行。每例卵泡液樣本取20 μL，5 倍稀釋（20 μL 卵泡液+80 μL 濃度磷酸緩沖液，總體積100 μL）后加入透析管中，置于500 mL 濃度磷酸緩沖液 （磷酸緩沖液，pH 值8.0）的透析液中4 ℃過夜透析。透析后，每個樣本取35 μL，加入標記緩沖液至終體積190 μL，再加入22 g/L 使用濃度磷酸緩沖液（pH 值8.0）稀釋的標記試劑進行生物素標記。室溫震蕩30 min，在上述反應液中加入3 μL 終止液，進行第二次透析。蛋白芯片的每塊板（Block）加入800 μL 濃度封閉緩沖液，室溫封閉30 min。移除封閉緩沖液，每塊板加入400 μL 生物素標記過的卵泡液樣本（用封閉液20 倍稀釋后）。移除樣品，先后加入濃度洗液I 和濃度洗液Ⅱ洗滌。再加入熒光標記鏈霉親和素，室溫孵育2 h。移除熒光標記鏈霉親和素，再次洗滌。最后將蛋白芯片放入GenePix 4000B 芯片掃描儀進行掃描，使用GenePix Pro 6.0 軟件讀取數(shù)據(jù)。

1.3.3 蛋白芯片數(shù)據(jù)處理和差異表達蛋白的篩選 12 例樣本經(jīng)GenePix Pro 6.0 軟件解讀，獲得的熒光信號值包括熒光信號和背景等。去除背景的熒光信號后獲得507 個細胞因子的熒光信號值，數(shù)據(jù)經(jīng)過歸一化處理后進行分析。以PCOS 組熒光信號均值/對照組均值計算差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C），以1.5 倍調變?yōu)殚撝担‵C>1.5 或FC<0.67）篩選差異表達蛋白。

1.3.4 差異蛋白的生物信息學分析 使用人類蛋白質參考數(shù)據(jù)庫（Human Protein Reference Database，HPRD；http://www.hprd.org/）對差異蛋白的亞細胞定位、分子功能和生物過程進行注釋[9]。運用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）和KEGG 數(shù)據(jù)庫（http://www.kegg.jp）進行KEGG 通路分析[10-11]。使用STRING 數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org/）進行差異蛋白的蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡分析[12]，并利用Cytoscape 軟件（https://cytoscape.org/）進行可視化。進一步使用cytoHubba 插件根據(jù)每個蛋白節(jié)點的度（degree）值排序，蛋白的度值越高表明該蛋白與越多的其他蛋白存在互作；將度值最高的前10 個蛋白視為PPI 網(wǎng)絡中重要的蛋白，即核心蛋白。

2 結果

2.1 蛋白芯片檢測和差異表達蛋白譜的建立

2 組卵泡液樣本采用AAH-BLG-507 蛋白芯片檢測獲得熒光信號結果。去除背景后的熒光信號值經(jīng)歸一化處理后計算FC 值。以1.5 倍調變?yōu)殚撝担‵C>1.5 或FC<0.67），篩選獲得對照組和PCOS 組卵泡液差異表達蛋白74 個，其中表達上調25 個，表達下調49 個（表1）。表達上調最顯著的蛋白為CC 趨化因子配體24（C-C motif chemokine ligand 24，CCL24）、CXC 趨化因子受體3（C-X-C chemokine receptor 3，CXCR3）和CC 趨化因子配體28（CCL28），三者均屬于趨化因子/受體家族，在機體的免疫應答和免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用。表達下調最顯著的蛋白為白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和Wnt 信號通路抑制因子（Dickkopf-1，DKK1），兩者參與細胞增殖、組織修復和胚胎發(fā)育等生理過程。

表1 PCOS 患者卵泡液的差異表達蛋白Tab 1 Differential expressed proteins identified from follicular fluid of women with PCOS

2.2 差異蛋白的功能注釋分析

圖1 卵泡液中差異蛋白的分類Fig 1 Categorization of differential proteins in follicular fluid

將篩選出的74 個差異表達蛋白根據(jù)HPRD 網(wǎng)站進行功能注釋。根據(jù)亞細胞定位，大多數(shù)蛋白（52%）位于胞外區(qū)，其次為質膜區(qū)（35%），見圖1A。根據(jù)分子功能，19%和14%的蛋白分別與細胞因子活性和趨化因子活性相關，其余主要的蛋白功能為受體活性（11%）、生長因子活性（10%）和G 蛋白偶聯(lián)受體活性（7%），見圖1B。根據(jù)參與的生物學過程，大多數(shù)蛋白（57%）參與細胞通訊和信號轉導，其次為免疫應答（20%）和蛋白質代謝（12%），見圖1C。

2.3 差異蛋白的KEGG 分析

對74 個差異表達蛋白進行KEGG 通路分析，結果顯示，富集到的蛋白數(shù)最多的3 條通路為細胞因子間受體相互作用通路（P=5.48×10-37）、趨化因子信號通路（P=1.27×10-12）和JAK-STAT 信號通路（P=2.79×10-7）。圖2 展示了分別富集到36 個蛋白（48.65%）和17 個蛋白（22.97%）的細胞因子間受體相互作用通路和趨化因子信號通路。

圖2 差異蛋白富集所得的KEGG 通路Fig 2 KEGG pathway enriched by differential proteins

2.4 差異蛋白的PPI 網(wǎng)絡分析

運用STRING 軟件進行差異蛋白的PPI 網(wǎng)絡分析，并將結果在Cytoscape 軟件中進行可視化（圖3）。使用cytoHubba 插件對蛋白節(jié)點的度值進行排序，度值前10 的核心蛋白從高到低分別為CCR7、CXCR3、CCR1、CXCR2、CXCR1、IL10、KNG1、IL4、CXCL11、CX3CL1（圖4），其中CCR7、CCR1、CXCR2、CXCR1、IL10、KNG1、IL4、CXCL11 在PCOS 患者卵泡液中表達下調，CXCR3 和CX3CL1 表達上調（圖3）。

圖3 差異蛋白的蛋白互作網(wǎng)絡圖Fig 3 PPI network of differential proteins

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡中的核心蛋白Fig 4 Hub proteins of PPI network

3 討論

PCOS 是一種復雜的臨床異質性疾病，PCOS 女性罹患2 型糖尿病和心血管疾病的風險更高。越來越多的研究表明慢性低度炎癥不僅與PCOS 發(fā)病機制相關，還與胰島素抵抗、遠期代謝性疾病及心血管并發(fā)癥相關[13]。近年來，蛋白質組學技術的興起為疾病的基礎研究提供了高效的技術平臺。與傳統(tǒng)的靶向技術相比，蛋白質組學技術更適合PCOS 這種異質性疾病，因其能得到更加完整和全面的代謝及代謝譜改變信息[14]。

既往關于PCOS 患者卵泡液的蛋白質組學研究主要采用質譜分析、液相色譜-串聯(lián)質譜和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜等技術，鮮有使用蛋白芯片技術篩選PCOS 患者卵泡液中的差異表達蛋白。研究表明，PCOS患者卵泡液中的差異蛋白及其涉及的通路與胰島素功能調節(jié)、脂代謝、炎癥反應和卵泡的生長發(fā)育有關[15-17]。Ambekar 等[15]選取的PCOS 患者平均BMI 水平處于超重范圍；尚無關于非超重/肥胖的PCOS 患者卵泡液差異蛋白的研究。故本研究選取正常BMI 水平的PCOS 患者為研究對象，采用AAH-BLG-507 蛋白芯片技術，觀察其與BMI 匹配的非PCOS 患者卵泡液中細胞因子的表達變化。

通過比較6 例PCOS 患者和6 例非PCOS 患者卵泡液中507 種細胞因子的表達水平，篩選出74 個差異蛋白，其中表達上調25 個，表達下調49 個。功能注釋分析結果顯示，差異蛋白主要的分子功能為細胞因子活性和趨化因子，參與的生物學過程為細胞通訊、信號轉導和免疫應答。KEGG 通路分析指出，富集到的通路主要涉及細胞因子間受體相互作用和趨化因子信號通路。進一步的PPI 網(wǎng)絡分析和核心蛋白篩選的結果顯示，核心蛋白的類型主要為趨化因子及其受體。

趨化因子是一類具有細胞因子活性的小蛋白家族，能將免疫系統(tǒng)中的細胞募集到感染或組織損傷部位，并在免疫應答的不同階段調節(jié)免疫細胞的激活狀態(tài)。既往研究顯示，部分趨化因子家族成員與PCOS 相關：非超重PCOS女性血清中單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1/CCL2）水平較正常女性升高[18]；PCOS患者血清趨化因子CX3C 配體1（chemokine CX3C motif ligand 1，CX3CL1）水平升高，升高的CX3CL1 水平與胰島素抵抗、慢性炎癥和雄激素水平相關[19]；此外，PCOS患者血清 趨化因子CXC 配體11（CXCL11）、趨化因子CXC 配體4（CXCL4）、單核細胞趨化蛋白-4（MCP-4/CCL13）等趨化因子水平還與性激素水平存在相關性[20]。

PCOS 女性不僅生育能力受損，發(fā)生肥胖、胰島素抵抗、2 型糖尿病、脂代謝紊亂和心血管疾病的風險也進一步增加[1,3-4]。胰島素抵抗是PCOS 的核心發(fā)病機制之一。與BMI 匹配的對照組相比，肥胖和非肥胖PCOS 組患者的胰島素抵抗都更為嚴重[21-22]。目前，已有越來越多的證據(jù)顯示趨化因子及其受體與肥胖、胰島素抵抗和慢性炎癥相關。CC 趨化因子受體7（C-C chemokine receptor type 7，CCR7）主要在免疫細胞上表達，CCR7 及其配體通過在T 細胞和樹突狀細胞間的相互作用是天然免疫和獲得性免疫間的橋梁[23]。研究[24]顯示，CCR7-/-小鼠的糖耐量和胰島素敏感性顯著降低，肝臟脂肪變性更嚴重。CC 趨化因子受體1（CCR1）在人單核細胞、巨噬細胞和T 細胞上表達，CCR1 通過防止過多的T 細胞和單核細胞流入動脈粥樣硬化的血管壁，具有抗動脈粥樣硬化作用[25]。CXC 趨化因子受體1（CXCR1）和CXC 趨化因子受體2（CXCR2）是白介素8 的受體，使用兩者的阻斷劑能改善db/db 小鼠的糖耐量、胰島素抵抗和肝臟脂肪沉積，且CXCR2-/-小鼠能夠免受肥胖誘導所致的胰島素抵抗[26-27]。CXCL11 水平在肥胖患者中顯著升高，通過抑制內臟脂肪的血管生成在肥胖患者中促進了脂肪沉積[28]。CXCR3通路在內臟脂肪組織的炎癥反應中起著重要作用。與高脂喂養(yǎng)（high fat diet，HFD）的野生型小鼠相比，HFDCXCR3-/-小鼠的空腹血糖水平更低，糖耐量更高，單核細胞內臟脂肪浸潤和巨噬細胞炎癥程度較輕[29]。CX3CL1是CX3C 趨化因子家族中的唯一成員，能調節(jié)單核細胞對脂肪細胞的黏附，與肥胖、胰島素抵抗和2 型糖尿病相關[30]。可見，上述趨化因子/受體在糖脂代謝、炎癥和胰島素抵抗中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。卵泡液中CCR7、CCR1、CXCR3 和CX3CL1 的表達變化也可能參與PCOS患者卵巢局部的代謝和慢性炎癥的調節(jié)。肥胖小鼠或人體中CXCR1、CXCR2 和CXCL11 的表達變化趨勢與PCOS患者卵泡液中相反，可能與卵泡液和血清樣本的不同有關（卵泡液主要反映卵巢局部細胞因子合成和分泌的變化），也可能與本研究納入的是非肥胖患者有關。PCOS 患者卵泡液中趨化因子/受體及其相關信號通路表達的變化可能導致卵泡液局部的慢性低度炎癥和胰島素抵抗，促進卵泡膜細胞分泌更多的雄激素和影響顆粒細胞功能，最終導致卵泡發(fā)育異常。

除趨化因子家族外，本研究發(fā)現(xiàn)2 種抗炎細胞因子白介素10（interleukin，IL-10）和白介素4（IL-4）在PCOS女性的卵泡液中表達下調。IL-10 通過Th1 細胞和巨噬細胞下調促炎細胞因子的表達。既往研究也顯示，PCOS 女性卵泡液中的IL-10 水平較正常女性降低，促炎和抗炎細胞因子的不平衡會導致類固醇激素生成改變，卵泡成熟延遲和卵巢功能障礙[31]。IL-4 參與調控糖脂代謝，IL-4 在改善胰島素敏感性和糖耐量的同時能抑制脂質的堆積[28]。

綜上，運用蛋白芯片技術能夠建立PCOS 卵泡液差異表達蛋白譜，篩選所得的差異蛋白涉及細胞因子間受體相互作用和趨化因子信號通路，可能與卵泡液局部的胰島素抵抗和慢性低度炎癥相關，進而影響卵泡的生長發(fā)育，對PCOS 的早期診斷、發(fā)病機制和并發(fā)癥的研究具有一定的提示作用。本研究是一個小樣本量的蛋白質組學研究，篩選所得的差異表達蛋白有待于進一步擴大樣本量并定量測定來驗證，在更深入地理解PCOS 的發(fā)病機制、預防心血管代謝并發(fā)癥，以及尋找新的診療方面具有潛在的應用 價值。

參·考·文·獻

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