王曉丹，楊 釗，沈帆霞,

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院，上海201801；2. 美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)系腦血管研究中心，舊金山94110，美國(guó)

腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）載體是一種單鏈DNA 病毒，屬于非致病的、輔助病毒依賴(lài)型的細(xì)小病毒家族成員。與其他病毒載體相比，AAV 具有免疫原性較低、能夠感染分裂和非分裂細(xì)胞、介導(dǎo)目的基因在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)等特點(diǎn)[1]。AAV 可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究和基因治療理想的重組病毒載體。

AAV 載體有多種血清型，然而大多數(shù)血清型由于不能通過(guò)血腦屏障（brain blood barrier，BBB），僅能通過(guò)立體定向注射等方法將其直接注射至腦中。經(jīng)靜脈給藥的9 型AAV（AAA serotype 9，AAV9）能有效通過(guò)新生小鼠和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的BBB 而受到廣泛的關(guān)注[2]。然而經(jīng)靜脈注射的AAV9 不僅介導(dǎo)基因在腦部表達(dá)，也可能在其他外周器官如肝臟和心臟表達(dá)。因此如何調(diào)控目的基因在病變部位表達(dá)已成為近年來(lái)基因治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。組織出現(xiàn)缺氧時(shí)，低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）與低氧反應(yīng)元件（hypoxia-responsive element，HRE）相互作用，可以誘導(dǎo)一系列缺氧響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)，如促紅細(xì)胞生成素和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。因此在啟動(dòng)子區(qū)加入9 個(gè)拷貝HRE 作為調(diào)控元件的AAV 載體能控制目的基因在缺血、缺氧區(qū)表達(dá)[3]。

自身互補(bǔ)AAV9（self-complementary AAV9，scAAV9）能夠介導(dǎo)目的基因在新生小鼠腦中穩(wěn)定表達(dá)，但當(dāng)目的基因的互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）片段大于2.1 kb，則無(wú)法構(gòu)建scAAV。因而，本研究用單鏈AAV9（single-stranded AAV9，ssAAV9） 構(gòu)建載體，探討通過(guò)靜脈注射含9 個(gè)拷貝HRE 的ssAAV9（AAV9-H9LacZ）是否能有效控制目的基因LacZ [β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）編碼基因]在成年小鼠腦缺血區(qū)表達(dá)，并研究其可轉(zhuǎn)染的腦細(xì)胞類(lèi)型，以期為腦血管病的基因治療提供新的方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 周齡CD-1 雄性小鼠購(gòu)自美國(guó)Charles River 實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)步驟均符合加州大學(xué)舊金山分校動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。小鼠在清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，每籠5 只，溫度控制在（25.0±1.0）℃。

1.2 AAV9-H9LacZ 構(gòu)建和病毒包裝

AAV9 載體購(gòu)自Vector Biolabs（美國(guó)），其中含β-gal編碼基因的啟動(dòng)子（pβgal）。載體以Sma Ⅰ和Hind Ⅲ 為酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切，在2 個(gè)末端反向重復(fù)序列（inverted terminal repeats，ITRs）之間插入LacZ cDNA 質(zhì)粒，并將9 個(gè)拷貝HRE 作為啟動(dòng)子用來(lái)控制LacZ 基因表達(dá)[4]。AAV9-H9LacZ 病毒的包裝采用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法（helperfree AAV 包裝系統(tǒng)）。2 個(gè)輔助質(zhì)粒（其中一個(gè)攜帶腺病毒的VA、E2A 和E4 區(qū)，另一個(gè)攜帶AAV 的Rep 和Cap基因）和AAV9-H9LacZ 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，包裝AAV 重組病毒載體。采用氯化銫梯度離心純化病毒。通過(guò)DNA 斑點(diǎn)雜交分析確定病毒滴度[5]。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

取12 只小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組和腦缺血組，每組6 只。在遠(yuǎn)端大腦中動(dòng)脈閉塞（distal middle cerebral artery occlusion，dMCAO）模型建立1 d 和5 d 后處死。取小鼠新鮮腦組織提取蛋白用于Western blotting，并制備石蠟切片用于免疫組織化學(xué)染色。

另外取12 只小鼠，全部建立dMCAO 模型，隨機(jī)分為對(duì)照組和AAV9-H9LacZ 組，每組6 只。dMCAO 模型建立后1 h 分別靜脈注射生理鹽水和AAV9-H9LacZ 病毒。模型建立5 d 后處死，取小鼠新鮮腦組織制備冰凍切片用于免疫熒光染色，取腦組織和肝臟組織用于5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷酶（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，X-gal）染色。

1.4 dMCAO 模型建立

1.5%異氟烷吸入麻醉小鼠。手術(shù)顯微鏡下，在右側(cè)眼眶和耳屏間切1 cm 切口。移除約2 mm2的頭骨后，用電凝阻塞大腦中動(dòng)脈。后將骨板、顳肌復(fù)位并縫合皮膚。在手術(shù)過(guò)程中用熱毯將體溫保持在（37.0±0.5）℃。用激光多普勒血流儀（Vasamedics 公司，美國(guó)）監(jiān)測(cè)小鼠表面腦血流（surface cerebral blood flow，sCBF），如小鼠缺血核心區(qū)的sCBF 超過(guò)基線(xiàn)的15%則除外。

1.5 AAV9-H9LacZ 的靜脈注射

AAV9-H9LacZ 組在小鼠dMCAO 模型建立后1 h，經(jīng)頸靜脈注射溶解在200 μL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）的AAV9-H9LacZ [1×1012GC，GC為基因組拷貝（genome copy）]。對(duì)照組經(jīng)頸靜脈注射等量的生理鹽水。

1.6 Western blotting 檢測(cè)

利用BCA（bicinchoninic acid）法測(cè)定蛋白濃度。蛋白經(jīng)7%～12%梯度凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，抗HIF-1α 抗體（1:500 稀釋?zhuān)籒ovus 公司，美國(guó)）室溫孵育1 h，PBS清洗后，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體（1:2 000 稀釋?zhuān)籄mersham 公司，美國(guó)）孵育。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光反應(yīng)試劑盒（Amersham 公司，美國(guó)），曝光，顯影。用Image J 1.63 軟件定量分析蛋白條帶。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

腦組織切片以抗HIF-1 抗體 （1:500 稀釋?zhuān)籆hemicon 公司，美國(guó)）孵育60 min，PBS 洗滌，滴加生物素化的二抗，PBS 洗滌，3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。

1.8 免疫熒光染色

dMCAO 模型建立5 d 后處死小鼠，腦組織迅速冷凍保存在－80℃。然后置恒冷冰凍切片機(jī)，由嘴側(cè)向尾側(cè)行序列冰凍切片，腦冠狀切片厚20 μm。免疫熒光染色所需特異性抗體為血小板 - 內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）抗體（1:50 稀釋?zhuān)籄bD Serotec 公司，英國(guó)）、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（1:500 稀釋?zhuān)籗igma-Aldrich 公司，美國(guó)）、神經(jīng)元特異核蛋白（neuron-specific nuclear protein，NeuN）抗體（1:500 稀釋?zhuān)籆hemicon 公司，美國(guó)）和β-gal 抗體（1:500 稀釋?zhuān)籄bcam公司，美國(guó)）。樣本在一抗溶液中孵育90 min，在二抗Alexa 594 抗小鼠IgG 和Alexa 488 抗兔IgG（1:500 稀釋?zhuān)籌nvitrogen 公司，美國(guó)）中孵育60 min 后，用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的防熒光淬滅封片劑（vectashield）封片。以PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。用德國(guó)Leica DMLS 熒光顯微鏡采集圖像，每張切片在腦梗死周邊區(qū)選取2 個(gè)高倍視野。各組所選部位相同，用Image J 1.63 軟件對(duì)β-gal 陽(yáng)性細(xì)胞定量分析。

1.9 X-gal 染色

腦和肝臟組織制備20 μm 厚冠狀切片，用0.5%戊二醛固定 10 min 后，在X-gal 溶液（5 mmol/L 鐵氰化鉀、5 mmol/L 亞鐵氰化鉀、2 mmol/L 氯化鎂、0.01%脫氧膽酸鈉、1 mg/mL X-gal）中孵育2 h。梯度乙醇脫水，封片，腦片掃描。藍(lán)色所示為β-gal 陽(yáng)性區(qū)，淺紅色為腦缺血區(qū)。定量分析結(jié)果以β-gal 陽(yáng)性區(qū)面積占腦缺血區(qū)面積的百分比表示。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量數(shù)據(jù)以x—±s 表示。組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦缺血區(qū)HIF-1 的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，dMCAO 模型建立1 d和5 d 后 HIF-1 在腦缺血區(qū)陽(yáng)性表達(dá)（圖1A）。Western blotting 結(jié)果見(jiàn)圖1B，局灶性腦缺血1 d 和5 d 后，小鼠缺血病灶局部HIF-1 的表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.049，P=0.007）。

圖1 HIF-1 在腦缺血區(qū)的表達(dá)Fig 1 Expression of HIF-1 in the ischemic area

2.2 腦缺血區(qū)β-gal 的表達(dá)

在dMCAO 模型建立1 h 后，將AAV9-H9LacZ 經(jīng)頸靜脈注入小鼠體內(nèi)。dMCAO 模型建立后第5 日，處死小鼠，取腦組織制備切片。AAV9-H9LacZ 組和對(duì)照組可見(jiàn)左側(cè)大腦中動(dòng)脈區(qū)域出現(xiàn)缺血灶，提示造模成功。X-gal染色結(jié)果顯示，AAV9-H9LacZ 組的腦缺血區(qū)周?chē)ㄈ毖氚祹^(qū)）可見(jiàn)深藍(lán)色的β-gal 陽(yáng)性表達(dá)，在缺血區(qū)中心可見(jiàn)少量的β-gal 表達(dá)，在其他區(qū)域偶見(jiàn)β-gal 表達(dá)，而對(duì)照組在腦缺血區(qū)周?chē)推渌麉^(qū)域均未檢測(cè)到β-gal 表達(dá)（圖2A）。定量分析結(jié)果見(jiàn)圖2B，2 組β-gal 陽(yáng)性區(qū)占腦缺血區(qū)面積的百分比的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。提示經(jīng)靜脈注射的AAV9-H9LacZ 能通過(guò)BBB 進(jìn)入腦部，并主要在缺血區(qū)周?chē)磉_(dá)。

圖2 X-gal 染色檢測(cè)β-gal 在腦缺血區(qū)的表達(dá)Fig 2 Expression of β-gal in the ischemic area detected by X-gal staining

2.3 腦缺血區(qū)β-gal 陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型

免疫熒光結(jié)果顯示，腦缺血5 d 后大量β-gal 陽(yáng)性細(xì)胞存在于腦缺血區(qū)周?chē)?。?gal 陽(yáng)性細(xì)胞主要表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP，少部分β-gal 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN，幾乎未見(jiàn)β-gal 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31（圖3A）。隨機(jī)選取2 個(gè)視野（圖3B），定量分析β-gal/GFAP 共表達(dá)、β-gal/NeuN 共表達(dá)以及β-gal/CD31 共表達(dá)的細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)β-gal/GFAP 共表達(dá)的細(xì)胞數(shù)最多（P=0.000），見(jiàn)圖3C。

圖3 腦缺血區(qū)β-gal 陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型Fig 3 Types of β-gal positive cells in the cerebral ischemic area

2.4 肝臟組織中β-gal 的表達(dá)

在小鼠的肝臟組織中，AAV9-H9LacZ 組及對(duì)照組未檢測(cè)到明顯的β-gal 表達(dá)（圖4）。

圖4 肝臟組織β-gal 的表達(dá)（X-gal 染色）Fig 4 Expression of β-gal in the liver tissue (X-gal staining)

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的關(guān)鍵是載體能夠介導(dǎo)目的基因通過(guò)BBB 或者直接進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。AAV 有多種血清型，許多AAV 載體不能通過(guò)正常的BBB，只能通過(guò)立體定向注射等有創(chuàng)方法將病毒注射至腦部。直接注射是一種侵入性的方法，可導(dǎo)致患者的額外傷害，因而制約了AAV 載體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療中的運(yùn)用。

經(jīng)靜脈注射AAV9 載體能通過(guò)BBB，介導(dǎo)目的基因在腦部表達(dá)。但中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的器官如肝臟、心臟、腎臟和骨骼肌等，也有目的基因的高表達(dá)。鑒于基因的過(guò)度表達(dá)會(huì)給宿主帶來(lái)危害，因此如何調(diào)控基因的表達(dá)及其時(shí)間是基因治療的關(guān)鍵。

既往研究[3]顯示腦缺血模型建立1 h，用立體定向注射AAV1-H9LacZ 至腦缺血邊緣區(qū)域能介導(dǎo)LacZ 基因在局部表達(dá)，注射至正常腦組織則無(wú)LacZ 基因表達(dá)。提示HRE 能控制目的基因僅僅在缺血和缺氧的條件下表達(dá)，為條件性地控制基因表達(dá)并進(jìn)行治療提供了新的方法。

本研究結(jié)果顯示選用AAV9-H9LacZ（1×1012GC）這一劑量，能使目的基因主要在腦缺血部位有效表達(dá)。我們的研究顯示在dMCAO 模型建立1 h 后靜脈注射AAV9-H9LacZ 能通過(guò)BBB，介導(dǎo)LacZ 基因在缺血區(qū)及周?chē)鷧^(qū)表達(dá)。而正常腦組織和外周器官并未見(jiàn)到明顯的LacZ 基因表達(dá)，提示AAV9-H9LacZ 不能介導(dǎo)目的基因在正常組織表達(dá)。因此，通過(guò)非侵入性地靜脈注射AAV9-H9LacZ可以介導(dǎo)目的基因在腦部表達(dá)。dMCAO 模型建立1 d和5 d 后，小鼠腦缺血組織局部HIF-1 的表達(dá)增高，提示HRE 能限制基因在腦缺血區(qū)周?chē)谋磉_(dá)，即9 拷貝的HRE 能控制治療基因局限在缺血區(qū)及周邊區(qū)域表達(dá)。

AAV9 能介導(dǎo)目的基因通過(guò)BBB[6]。主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)在促進(jìn)AAV9 跨越BBB 方面的作用機(jī)制已被證實(shí)[7]。在dMCAO模型建立后10 min 之內(nèi)BBB 通透性增加，并持續(xù)至少24 h 至數(shù)日。本研究發(fā)現(xiàn)缺血周?chē)鷧^(qū)LacZ 基因表達(dá)明顯高于腦的其他部位，提示除了AAV9 通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)通過(guò)BBB，腦缺血后的BBB 通透性增加可能也在其中起作用。

通過(guò)免疫熒光雙染色，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈注射的scAAV9 所介導(dǎo)的LacZ 基因主要轉(zhuǎn)染GFAP 陽(yáng)性細(xì)胞，少數(shù)NeuN 陽(yáng)性細(xì)胞有LacZ 基因的表達(dá)，幾乎無(wú)CD31 陽(yáng)性細(xì)胞有LacZ 基因的表達(dá)。盡管其他研究表明靜脈注射的scAAV9 能通過(guò)新生小鼠的BBB，主要轉(zhuǎn)染神經(jīng)元[8]，以及星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等[9]。但在成年小鼠中，scAAV9 能轉(zhuǎn)染星型膠質(zhì)細(xì)胞[10-11]。由于腦梗死后，星型膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生重要的形態(tài)學(xué)改變，如增生和肥大，形成膠質(zhì)瘢痕，圍繞損傷區(qū)形成物理和功能的壁壘[12]。鑒于腦缺血后局部神經(jīng)元死亡，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，我們推測(cè)在本研究中經(jīng)靜脈注射的ssAAV9 主要轉(zhuǎn)染至GFAP 陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，而非神經(jīng)元，這可能與腦缺血區(qū)大量神經(jīng)元的死亡有關(guān)。

既往研究[5]顯示靜脈注射AAV9 和生理鹽水組相比較，腦缺血體積無(wú)差異，提示靜脈注射AAV 載體并不加重腦缺血損傷。AAV 具有能夠在宿主細(xì)胞長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)、安全性高并與人類(lèi)疾病無(wú)相關(guān)性、病毒本身穩(wěn)定性好等多種優(yōu)點(diǎn)[13]。

總之，本研究表明靜脈注射ssAAV9 可介導(dǎo)基因通過(guò)成年小鼠BBB 通透性增加的相關(guān)區(qū)域。腦缺血后靜脈注射ssAAV9 介導(dǎo)的基因主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，部分在神經(jīng)元表達(dá)。此外通過(guò)與調(diào)控元件HRE 的結(jié)合，目的基因可以被局限在腦損傷區(qū)域表達(dá)，以減少由于目的基因在全身其他器官表達(dá)所導(dǎo)致的不良反應(yīng)。與調(diào)控元件結(jié)合的ssAAV9 可作為缺血性卒中及其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的安全、有效的載體。

參·考·文·獻(xiàn)

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