徐晟云，陳昆慈，羅青，劉海洋，歐密，上官清，趙建*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 廣州 510380； 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

鱧是中國重要的優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟魚類之一，2014年全國產(chǎn)量達51萬t[1]，養(yǎng)殖品種以烏鱧Channaargus、斑鱧Channamaculata和雜交鱧為主。其中，烏鱧生長快、個體大、抗寒能力強，主要在中國北方地區(qū)養(yǎng)殖；雜交鱧是以烏鱧和斑鱧為親本雜交獲得的養(yǎng)殖品種，表現(xiàn)出顯著的雜交優(yōu)勢，并能攝食人工配合飼料，是長江流域及以南水域主要養(yǎng)殖品種。近年來，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所培育出的新品種烏斑雜交鱧C.argus♀×C.maculata♂，以烏鱧為母本、斑鱧為父本，其具有較強的抗寒能力，在黃河流域及以北地區(qū)得到廣泛推廣[2]。

鱧具鰓上器，能夠呼吸空氣，適合高密度養(yǎng)殖，近年來，隨著養(yǎng)殖密度的不斷提高，其養(yǎng)殖過程中病害發(fā)生率高居不下，因此，提高鱧自身免疫能力及抗病能力已成為養(yǎng)殖過程中備受關(guān)注的一個課題。腸道微生物被譽為宿主的一個附加“器官”[3-4]。在腸道群落結(jié)構(gòu)中，微生物的失衡可能會阻礙宿主生理活動的進行，繼而引發(fā)疾病等。在魚類腸道里，有一些微生物會在形成過程中逐漸演變成固有群落，而有一些則形成了非固有菌群[5]。腸道微生物群落結(jié)構(gòu)特征組成和多樣性會影響營養(yǎng)物質(zhì)加工、消化，維持宿主能量平衡、免疫疾病和生長發(fā)育等生理活動[6-7]，研究者通過選擇不同餌料品種及適當(dāng)?shù)酿D料添加劑，促使養(yǎng)殖對象的腸道菌落結(jié)構(gòu)特征發(fā)生變化并朝著有益的方向發(fā)展[8]，從而提高養(yǎng)殖動物的生長和健康水平。因此，研究魚類腸道微生物群落結(jié)構(gòu)對于鱧的健康生態(tài)養(yǎng)殖有著極其重要的作用[9]。

本研究中，采用Illumina高通量測序技術(shù)對鱧16S rRNA基因進行測序并分析其腸道微生物組成，旨在探討不同環(huán)境下鱧腸道內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)特征，為研究鱧生長、疾病與腸道微生物結(jié)構(gòu)特征間的關(guān)系，以及促進鱧的健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年10—11月分別在珠海斗門(DM)、佛山南海(百容水產(chǎn)良種有限公司的水泥池BRSNC和池塘BRCT)、佛山順德杏壇(XT)、陽江(YJ)4個地區(qū)共5個點采集成年健康有活力的鱧樣品，無菌環(huán)境下解剖取其腸道內(nèi)容物后保存于液氮中帶回實驗室，共31個樣品，其中，陽江的樣品為野生斑鱧(50～100 g)，其他樣品均為雜交鱧(100～150 g)。樣品信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Sample information

1.2 方法

1.2.1 樣品基因組提取 采用CTAB法提取總樣品的DNA[10]：在裝有0.3 g樣品的離心管中加入1 mL 65 ℃條件下預(yù)熱的CTAB提取液和20 L蛋白酶K，65 ℃條件下烘箱溫浴30 min，之后以8000 r/min離心5 min。取上清液800L至2.0 mL無菌離心管中，加入800 L氯仿/異戊醇(24∶1)，以12 000 r/min離心20 min。吸取上清液600 L至2.0 mL無菌離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)，以12 000 r/min離心20 min。再吸取上清液400 L至1.5 mL無菌離心管中，加入2/3體積的異丙醇和1/10體積的乙酸鈉，充分混勻,于-20 ℃下放置1 h。以12 000 r/min離心10 min，棄上清，瞬時離心，離心管開蓋，在37 ℃條件下烘箱晾干10 min至DNA沉淀呈半透明狀。加入100 L無菌ddH2O，溶解DNA沉淀，37 ℃下水浴鍋消化1 h后，-20 ℃條件下保存，送至北京邁克生物科技有限公司完成16S rRNA基因擴增子測序。

1.2.2 16S rRNA 基因擴增子測序 對DNA樣品中16S rRNA基因v3～v4區(qū)域進行測序及信息分析。采用通用引物338F:5′ACTCCTACGGGAGGCAGCA 3′和806R:5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3′用于擴增16S rRNA基因的v3～v4區(qū)域進行Illumina深度測序。PCR反應(yīng)體系(20L)：ddH2O 13.25 μL，DNA模板(100 ng/mL) 0.5 μL，10×PCR ExTaq Buffer 2.0 μL，Prime 1 (10 mmol/L) 1.0 μL，Prime 2 (10 mmol/L) 1.0 μL，dNTP 2.0 μL，ExTaq (5 U/mL) 0.25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃下循環(huán)變性30 s，58 ℃下退火復(fù)性20 s，72 ℃下延伸6 s，共進行30個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸7 min。然后取5 μL PCR產(chǎn)物使用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳法純化和回收擴增產(chǎn)物。使用Qubit 2.0熒光計測定濃度并連接接頭完成文庫構(gòu)建。檢測文庫片段范圍和濃度后，選擇Illumina HiSeq 2500平臺對文庫進行測序。

1.2.3 信息分析流程 根據(jù)PE reads間的重疊關(guān)系,將測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)組成一條序列Tags,同時過濾reads的質(zhì)量和合并效果。使用FLASH 1.2.7軟件拼接重疊各樣品的reads，獲得原始的數(shù)據(jù)(Raw Tags)；使用Trimmomatic 0.33軟件過濾不合格的原始數(shù)據(jù),得到合格的數(shù)據(jù)(Clean Tags)后，使用UCHIME 4.2軟件鑒定識別嵌合序列同時去除不合格的雜質(zhì),得到有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

(1)OTU分析。OTU(Operational Taxonomic Units)是人為給某一個單元(品系、種、屬等)設(shè)置的分類標(biāo)志。在相似性 97% 的水平上，使用QIIME 1.8.0軟件中的 UCLUST聚類Tags，劃分操作分類單元[11]。

(2)Alpha 指數(shù)分析。 Alpha 多樣性是指一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，是反映豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。群落豐富度的指數(shù)主要包括Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)；群落多樣性指數(shù)主要包括Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。其中，Chao1指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高；ACE指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高；Shannon指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高；Simpson 指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低[12]。Alpha指數(shù)可用Mothur 1.30軟件分析得出。

(3)稀釋性曲線分析。稀釋性曲線[13]是從樣本中隨機抽取一定數(shù)量的個體，統(tǒng)計這些個體所代表的物種數(shù)目，并以個體數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)建曲線。當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理。利用Mothur 1.30軟件進行Rarefaction 分析，利用Perl 語言工具制作曲線圖。

(4)熱圖分析。 Heatmap[14]通過顏色梯度及相似程度來反映多個樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。利用R語言的Vegan 包、Vegdist和Hclust 進行距離計算和聚類分析；用Chao算法計算距離，Complete方法聚類，將聚類后數(shù)據(jù)表示在Heatmap 圖上。

(5)PCA分析。 主成分分析 (Principal Component Analysis,PCA)[15]運用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，兩個樣品距離越近，則表示這兩個樣品的組成越相似。使用R語言工具分別繪制PCA分析圖。

2 結(jié)果與分析

本試驗中31個樣品測序共獲得2 636 884對reads，拼接、過濾后共產(chǎn)生1 768 461條合格序列(Clean Tags)，每個樣品至少產(chǎn)生25 112條合格序列。

2.1 鱧腸道微生物物種多樣性

從表2可見，4個地區(qū)5個采樣點共31個樣品之間具有的OTU數(shù)量不同，其中CA50樣品OTU數(shù)最多(359個)，M8樣品OTU數(shù)最少(34個)，本試驗樣品中獲得微生物總OTU數(shù)為585個。

將4個地區(qū)樣品間共有及特有OTU數(shù)目通過Venn圖展示。從圖1可見：4個地區(qū)5種不同環(huán)境共同擁有的OTU數(shù)為119個，占4個地區(qū)總OTU數(shù)的20.34%，分別占佛山南海池塘OTU總數(shù)的23.66%(OTU總數(shù)503)、佛山南海水泥池OTU總數(shù)的28.23%(OTU總數(shù)421)、杏壇OTU總數(shù)的30.13%(OTU總數(shù)395)、陽江OTU總數(shù)的42.5%(OTU總數(shù)280)、珠海斗門OTU總數(shù)的48.77%(OTU總數(shù)244)。

2.2 鱧腸道微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性差異

2.2.1 稀釋曲線結(jié)果 從圖2可見：抽樣reads在10 000以下時，隨著測序條數(shù)的加大，每一條曲線起始時表現(xiàn)為急劇上升，這表明鱧腸道內(nèi)容物中有大量不同菌群被發(fā)現(xiàn)；在10 000～30 000時，曲線的序列數(shù)越來越趨于平緩，表示該環(huán)境的物種未檢測出來的測序數(shù)量不會再顯著增加，即此次檢測的微生物已近乎飽和，更多的測序量對發(fā)現(xiàn)新的OTU邊際貢獻較小，本測序數(shù)據(jù)量合理，反映出樣品多樣性的完整度；但當(dāng)抽樣reads超過30 000時曲線略微上升，可能是因為某些原因致使腸道中殘留了少許的菌群或少數(shù)細菌死亡后未被檢測出[16]。

2.2.2 腸道微生物Alpha多樣性 從表2可見：每個樣品的Coverage值均達到了99%以上，這說明每個樣品序列幾乎全被檢測出且達到飽和狀態(tài)，OTU覆蓋率數(shù)值越高，樣本物種檢測概率則越高。Coverage值可反映此次樣品中腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)組成及多樣性的真實性，每個樣品的Coverage值均接近百分百，證實了此次試驗數(shù)據(jù)的可靠性。

表2 OTU數(shù)及Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計Tab.2 Statistics of OTU number and Alpha diversity index

比較31個樣品的Alpha多樣性發(fā)現(xiàn)：CA50的Chao1值最大，高達364.181 8，說明這個樣品里的微生物菌群豐富度最大；CA44的Simpson值最小，為0.018 5，Shannon值最大，為4.522 2，說明此樣品的腸道微生物群落多樣性最大。

2.3 鱧腸道微生物群落組成分析

從表3可見：佛山南海池塘養(yǎng)殖的鱧腸道內(nèi)容物中，優(yōu)勢菌群主要為紅球菌屬Rhodococcus(12%)、鯨桿菌屬Cetobacterium(7%)、梭菌屬(1.5%)、微桿菌屬Aurantimicrobium(5%)、鄰單胞菌屬Plesiomonas(0.5%)、未培養(yǎng)的細菌Mycoplasmataceae(20.5%)；佛山南海水泥池養(yǎng)殖鱧的腸道內(nèi)容物中，優(yōu)勢菌群主要為弧菌屬Vibrio(30%)、微桿菌屬(5.5%)、紅球菌屬(5.17%)、梭菌屬(1.5%)、鯨桿菌屬(0.2%)、未培養(yǎng)的細菌Mycoplasmataceae(2%)；珠海斗門池塘養(yǎng)殖鱧腸道中，優(yōu)勢菌群主要為梭菌屬(79%)、紅球菌屬(4%)、微桿菌屬(3%)、氣單胞菌屬Aeromonas(2%)；佛山順德杏壇池塘養(yǎng)殖鱧腸道中，優(yōu)勢菌群主要為鯨桿菌屬(27%)、梭菌屬(22.2%)、紅球菌屬(3%)、弧菌屬(0.5%)；陽江野生斑鱧腸道中，優(yōu)勢菌群主要為鯨桿菌屬(40.5%)、梭菌屬(22.5%)、鄰單胞菌屬(20%)、氣單胞菌屬(8%)、紅球菌屬(3.1%)。

表3 屬水平上鱧腸道微生物優(yōu)勢菌群占比Tab.3 Microbial dominant flora in intestine of snakehead at the genus level %

根據(jù)31個樣品的微生物組成和相對豐度進行物種熱圖分析，更加詳細地表述了不同地區(qū)的優(yōu)勢菌群具有明顯差異。從圖3可見：佛山南海水泥池(BRCT)養(yǎng)殖鱧腸道的優(yōu)勢菌群主要有腸球菌屬Enterococcus、乳桿菌屬Lactobacillus、擬桿菌屬Bacteroides、Prevotella(屬于擬桿菌屬)、Bosea(屬于變形桿菌屬Proteus)、Phreatobacter(屬于變形桿菌屬)、Rhodobacter(屬于變形桿菌屬)等；而佛山南海池塘養(yǎng)殖鱧腸道中的優(yōu)勢菌群則為棒桿菌屬Corynebacterium、短桿菌屬Brevibacterium、Cloacibacterium(屬于擬桿菌屬)、梭菌屬、Massilia(屬于變形桿菌屬)、羅斯氏菌屬Rothia等；珠海斗門(DM)養(yǎng)殖鱧腸道微生物優(yōu)勢菌群相對集中，只有弧菌屬和梭菌屬；佛山順德杏壇(XT)養(yǎng)殖鱧腸道的優(yōu)勢菌群有假單胞菌屬Pseudomonas、泛菌屬Pantoea、假單胞菌屬Acinetobacter、短波單胞菌屬Brevundimonas等；陽江(YJ)采集的野生鱧腸道內(nèi)容物中，優(yōu)勢菌群有葡萄球菌Staphylococcus、梭菌屬、氣單胞菌屬等。熱圖分析發(fā)現(xiàn)，鱧腸道微生物群落中還包含了變形桿菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、擬桿菌屬、棒桿菌屬等其他菌屬，但是占比不高，說明菌群數(shù)量不多。

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)差異分析

對菌群結(jié)構(gòu)進行主成分分析，結(jié)果顯示：第三象限中有佛山南海水泥池(BRCT)、池塘(BRCT)，以及佛山順德杏壇(XT)養(yǎng)殖鱧、陽江的野生鱧、腸道微生物群落形成一個組群，說明這些地區(qū)鱧腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異較??；第二象限中只有珠海斗門(DM)樣品；第四象限中包含佛山南海池塘的個別樣品及佛山順德杏壇的個別樣品；第一象限中全部為陽江(YJ)的野生斑鱧(圖4)。PCA分析發(fā)現(xiàn)，人工養(yǎng)殖雜交鱧的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)比較接近，與野生鱧的群落結(jié)構(gòu)具有一定差異。

3 討論

3.1 不同環(huán)境下的微生物多樣性和豐度

本研究中不同環(huán)境中鱧腸道內(nèi)容物樣品間OTU個數(shù)具有一定的差別，總數(shù)達到585個，共同擁有的OTU數(shù)為119個。李存玉[17]分析池塘養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)及其與益生菌調(diào)控的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，兩種養(yǎng)殖模式下牙鲆腸道樣品OTU總數(shù)為367個，共有OTU數(shù)為270個。黃麗麗等[18]比較冷水魚樣品時發(fā)現(xiàn)，總共聚成242個OTU。秦亞玲等[19]比較3處熱泉(堿性、酸性、中性)發(fā)現(xiàn)，分別聚類形成141、79、58個OTU。與上述研究相比，本研究中OTU總數(shù)更大，表明鱧腸道中微生物物種豐度更大，這可能是魚類腸道微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)與其生存的水環(huán)境及攝食條件不同等因素相關(guān)[20-21]。厚壁菌門為大多數(shù)脊椎動物腸道中的優(yōu)勢菌群[22]，而厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門等為魚類消化道中常見的微生物優(yōu)勢菌[23]。

3.2 不同環(huán)境下的優(yōu)勢菌群及其作用

通常情況下，淡水魚消化道中常見的微生物有氣單胞菌屬、鄰單胞菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬等，而海水魚消化道中常見的則為弧菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬等[24]。Huber等[25]使用了分子生態(tài)學(xué)方法對虹鱒Oncorhynchusmykiss腸道微生物群落進行研究，獲得了一些常規(guī)培養(yǎng)方法下不能發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢細菌，如肉桿菌Carnobacteriumcollins、肉毒桿菌Clostridiumbotulinum、硫酸鹽還原菌Sulfate-Reducingbacteria等。楊桂梅等[26]對用不同飼料投喂的暗紋東方鲀Takifuguobscurus的表皮、性腺和腸道進行研究分析，發(fā)現(xiàn)這些樣品中的菌落組成以弧菌為主。李學(xué)梅等[27]研究了3種常見養(yǎng)殖魚類的腸道微生物，其中斑點叉尾鮰腸道中的優(yōu)勢菌群為變形桿菌,而異育銀鯽和銀鯽腸道中優(yōu)勢菌群分別為梭桿菌屬和氣單胞菌屬。本研究樣品中優(yōu)勢菌群主要為紅球菌屬、鯨桿菌屬、梭菌屬、微桿菌屬、弧菌屬、氣單胞菌屬、鄰單胞菌屬等，其中，紅球菌屬屬于放線菌門，梭菌屬屬于厚壁菌門，這與國內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果相似，不同的是本研究中優(yōu)勢菌群并未出現(xiàn)腸桿菌屬、肉桿菌屬等微生物，這說明腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)會受到外界環(huán)境的影響而有所不同。

不同環(huán)境下的優(yōu)勢菌群存在顯著性差異，梭菌屬、紅球菌屬雖在所有樣品中均存在，但不同環(huán)境下所占比例不同，說明腸道微生物的組成受到環(huán)境的影響，這與Ni等[28]利用DGGE技術(shù)比對不同環(huán)境草魚的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)不同生活環(huán)境的草魚腸道微生物群落結(jié)構(gòu)不同的結(jié)果相似，李存玉等[29]通過比較分析池塘和工廠化養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)時也發(fā)現(xiàn)，兩種養(yǎng)殖模式下牙鲆腸道中的優(yōu)勢菌種類相同，但同種優(yōu)勢菌的數(shù)量分布存在較大差異。本研究中優(yōu)勢菌群不同也可能與宿主攝食飼料不同等因素息息相關(guān)，已有研究表明，食性是影響魚類腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的一個顯著因素[30]。Ward等[31]發(fā)現(xiàn)，食性對魚類腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)特征有顯著影響，Ingerslev等[32]和Ni等[33]的研究結(jié)果也表明，食性是影響腸道微生物菌落的主要因素之一。

此外，梭菌屬細菌可利用發(fā)酵碳水化合物和糖類為魚類提供機體生存所需能量，以促進生長、增強免疫功能和抗癌功能[34-35]。梭菌屬中的丁酸梭菌能促進擬桿菌的繁殖，擬桿菌屬細菌能利用多糖和釋放抗炎物質(zhì)以增強機體免疫系統(tǒng)的免疫能力，目前梭菌屬細菌已作為益生菌廣泛運用在魚類養(yǎng)殖中[36]。鯨桿菌屬可發(fā)酵多肽碳水化合物以及合成維生素B12[37]，紅球菌能夠利用有機化合物作為碳源和能源[38]，微桿菌細菌能抑制病原菌的活性，可用來生產(chǎn)抗菌劑[39]。

本研究中紅球菌屬、梭菌屬、微桿菌屬、擬桿菌屬等存在于鱧腸道中，其作為優(yōu)勢菌群可以促進鱧對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，并抵御病原菌的入侵，對機體的生長發(fā)育和健康起到重要作用，屬于有益菌。本試驗通過對不同環(huán)境下鱧腸道微生物種群結(jié)構(gòu)分析，獲得了正常狀態(tài)下鱧腸道微生物組成，為鱧腸道菌群調(diào)節(jié)、開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品，促進鱧健康養(yǎng)殖提供了數(shù)據(jù)參考。

4 結(jié)論

(1)不同環(huán)境的鱧腸道微生物類群數(shù)量和種類存在顯著差異。

(2)相同環(huán)境的鱧腸道微生物群落結(jié)構(gòu)較為接近，即人工養(yǎng)殖鱧的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)較為接近，而與野生鱧之間腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異明顯。