史文倩 黃花榮

【關鍵詞】 Toll 樣受體4;信號傳導通路;哮喘

支氣管哮喘是常見的、反復發(fā)作的氣道免疫炎癥性疾病，往往由多種因素所誘發(fā)，表現(xiàn)為氣道的高反應性、發(fā)作性氣道阻塞、肺功能減退等[1]。哮喘是由復雜的基因-免疫-環(huán)境等因素相互作用引起的[2]。Toll樣受體（TLR）在炎癥性和免疫性疾病中扮演著重要的角色，TLR通過固有免疫病原模式識別多種免疫細胞，啟動非特異性免疫應答以消除病原體[3]。其中TLR4與哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關[4]。有研究表明，TLR能夠引起炎癥因子釋放，抑制TLR4信號通路可有效降低TLR4相關炎性細胞因子的表達，這為哮喘的治療提供了新的思路[5]。本文就TLR4信號傳導通路的作用機制、TLR4信號轉導通路與哮喘發(fā)病機制、靶向TLR4治療哮喘的研究進展進行綜述。

一、TLR4結構與功能

TLR屬于模式識別受體（PRR），能夠直接識別外來病原體及其產(chǎn)物或宿主畸變和衰老凋亡細胞某些共有特定模式分子結構。目前，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了14種TLR，其中10種亞型在人類中表達，根據(jù)其分布部位可以分為胞膜型PRR和內(nèi)體膜型PRR[6]。胞膜型PRR包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10，它們分布在細胞膜表面，主要識別脂質和蛋白質;內(nèi)體膜型PRR包括TLR3、TLR7、TLR8和TLR9，它們分布在細胞器膜上，主要識別核酸。

1997年發(fā)現(xiàn)的TLR4是首個與髓樣分化因子2（MD-2）、CD14、脂質結合蛋白（LBP）和放射性保護性105kDa蛋白（RP105）等多種共同受體同時存在的TLR成員[7]。TLR4為Ⅰ型跨膜糖蛋白，由胞內(nèi)區(qū)、胞外區(qū)和跨膜區(qū)3部分組成。TLR4的N端，即胞外區(qū)包含大約16～28個亮氨酸富集重復序列（LRR），主要用來識別外源性病原體相關模式分子（PAMP）和內(nèi)源性損傷相關分子模式（DAMP）。TLR4的C端，即胞內(nèi)區(qū)包含一個結構相對保守的Toll/IL-1受體（TIR）結構域，負責起始胞內(nèi)信號傳導，引發(fā)下游適配器蛋白的招募[8-9]。

二、TLR4信號傳導通路與生物學作用

TLR4信號傳導分為MyD88依賴和MyD88獨立（TRIF依賴）通路。MyD88依賴通路負責促炎細胞因子的表達，而MyD88獨立通路介導Ⅰ型IFN和IFN誘導基因的誘導[10]。

1. MyD88依賴通路

革蘭陰性菌細胞壁外膜的脂多糖（LPS）是TLR4的特異性配體[11]。單純轉染TLR4不足以識別LPS，并且配體誘導的活化需要TLR4與細胞表面MD-2相結合[12]。MD-2與LPS相互作用，然后與TLR4的細胞外結構域非共價結合，形成TLR4/MD-2受體復合物[13]。LBP和CD14是增強LPS傳感的輔助分子，LBP能夠從聚集體中提取LPS單體并將其轉移到CD14中，CD14受體通過膜結合形式結合單體LPS并將其轉移到MD-2，促進六聚物復合物（TLR4/MD-2/LPS）2的形成，從而誘導含有TIR結構域的適配器蛋白的募集[14]。這些適配器通過TLR4細胞質尾部的TIR結構域與適配器上的TIR結構域之間的同質相互作用與TLR4簇相關聯(lián)。

在LPS刺激下，MyD88依次募集并激活IL-1R受體相關激酶4（IRAK-4）、IRAK-1、TNF受體相關因子6（TRAF6）[15]。IRAK-4不僅負責招募、激活IRAK-1，還負責降解IRAK-1，IRAK-2也在LPS/TLR4信號傳遞中起作用[16-17]。TRAF6與泛素結合酶13（UBC13）、泛素結合酶E2變異體1異構體A（UEV1A）形成復合物，激活轉化生長因子-β活化的蛋白激酶1（TAK1），然后TAK1激活下游IκB激酶（IKK）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路。IKKα、IKKβ、IKKγ形成復合物催化IκB蛋白磷酸化，這種磷酸化導致IκB蛋白的降解和隨后轉錄因子NF-κB的易位，進而引起IL-6、IL-12p40、TNF-α等多種炎癥因子的表達[18]。下游MAPK途徑的激活導致另一種轉錄因子AP-1的誘導，該因子在促炎細胞因子的表達中同樣發(fā)揮了作用[19]。此外，IκBε和IFN調(diào)節(jié)因子5（IRF5）也是MyD88通路下游的2個重要因子。在LPS刺激下，缺乏IκBε的巨噬細胞對IL-6的表達有缺陷，而對TNF-α的表達正常。在IL-6的啟動子區(qū)，IκBε可能與NF-κBp50亞基一起發(fā)揮作用[20]。以上就是TLR4的MyD88依賴通路，見圖1。

2. MyD88獨立（TRIF依賴）通路

該通路的激活發(fā)生在TLR4-MD2復合物內(nèi)化后的內(nèi)小體室。其激活涉及到TRIF相關適配器分子（TRAM）和含TIR結構域適配器誘導IFN-β（TRIF）的募集，TNF受體相關因子3（TRAF3）的激活，以及由TANK結合激酶1（TBK）和IKKε介導的IFN調(diào)節(jié)因子3（IRF3）核易位的誘導[21-22]。其中IRF3轉錄因子能夠促進Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，見圖1。

3. TLR4信號傳導通路觸發(fā)因素

3.TLR4信號傳導通路觸發(fā)因素除了識別外源性微生物PAMP外，TLR4還能識別內(nèi)源性DAMP，TLR4的細胞內(nèi)觸發(fā)因素包括高遷移率族蛋白B1（HMGB1）和細胞熱休克蛋白等，其中HMGB1與哮喘密切相關[23]。HMGB1是一種非組蛋白且普遍存在的染色體蛋白，在活性染色質中富集，是HMGB家族的一部分，由人的HMGB1基因（13q12）編碼[24]。HMGB1可與TLR4結合激活NF-κB引起下游的炎癥介質釋放，有研究表明，阻斷HMGB1活性能通過抑制氣道炎癥和調(diào)節(jié)肺成纖維細胞表型和激活來逆轉氣道重塑[25]。

4.TLR4參與載脂蛋白E（APOE）信號通路

APOE的主要功能是促進受體介導的內(nèi)吞和脂蛋白顆粒（例如極低密度脂蛋白和乳糜微粒）及膽固醇向細胞內(nèi)的轉運，此外APOE還具有促炎和抗炎作用，這取決于APOE的濃度。在鼠螨引起的哮喘小鼠模型中，APOE基因敲除小鼠表現(xiàn)出增強的氣道反應性和杯狀細胞增生[26]。與健康受試者及COPD患者相比，哮喘患者血漿中的APOE降低，IL-33升高[27]。研究證明高水平的APOE信號通過TLR4激活TAK1和IκKβ，IκKβ磷酸化NF-κBp65和TPL2，進而磷酸化c-Jun氨基末端激酶（JNK），從而誘導人哮喘小氣道上皮細胞（SAEC）分泌C-X-C基序趨化因子配體5（CXCL5）促進氣道炎癥[28]。

三、TLR4信號傳導通路與哮喘發(fā)病機制

1. TLR4與“衛(wèi)生假說”

Strachan提出了“衛(wèi)生假說”，該假說提出兒童期減少接觸傳染性微生物會導致后期過敏性疾病風險增加。病原微生物能夠促進免疫系統(tǒng)早期成熟，通過刺激1型輔助性T淋巴細胞（Th1）成熟，抑制Th2極化，最終降低IgE水平。相反，免疫成熟過程中的“干凈”環(huán)境可能導致Th2持續(xù)存在。接觸內(nèi)毒素可能為“衛(wèi)生假說”提供一種統(tǒng)一的機制。有研究表明，房屋灰塵和床墊灰塵中較高的內(nèi)毒素水平與變態(tài)反應致敏和特應性哮喘的風險較低有關[29]。PRR識別內(nèi)毒素，并通過由LPS、CD14、MD-2和TLR4形成的內(nèi)毒素受體復合物激活先天免疫系統(tǒng)。這說明TLR4與“衛(wèi)生假說”密切相關。

2. HMGB1與哮喘密切相關

2.HMGB1與哮喘密切相關HMGB1是一種高度保守的核蛋白，既可以由單核細胞、巨噬細胞和其他免疫細胞主動釋放到細胞外，也可從受損的壞死組織細胞中被動釋放，以促進多種炎癥因子分泌[30]。此外，HMGB1還具有細胞外活性，即HMGB1能在內(nèi)源性損傷相關分子模式中起作用，通過與晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）和TLR相互作用，調(diào)節(jié)參與磷酸化和糖基化終產(chǎn)物合成的受體，這些受體導致某些細胞因子如TNF-α、IL-4和IL-6的增加[31]。研究表明HMGB1與RAGE、TLR2和TLR4的相互作用會激活MAPK和NF-κB的細胞內(nèi)信號，引起促炎性細胞因子的激活和釋放[32]。

3. TLR4基因多態(tài)性與哮喘發(fā)生的風險

大量研究表明TLR2、TLR4和TLR9與哮喘或特應性疾病的發(fā)病機制有關[33]。TLR4多態(tài)性可以改變兒童的先天免疫反應，并可能是哮喘發(fā)展的重要決定因素。CD14通過促進LPS向TLR4的表達促進免疫激活，這會觸發(fā)IL-12和IL-18的信號傳導以及IFN產(chǎn)生。研究表明該反應受遺傳控制，由Asp299Gly（核苷酸取代896A>G）組成的TLR4基因（染色體9q32-33）中的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與吸入內(nèi)毒素攻擊的反應性低下，氣道上皮中TLR4的密度降低以及炎癥細胞因子對內(nèi)毒素的反應減少有關[34]。這種多態(tài)性改變了受體對內(nèi)毒素的反應，這是哮喘的重要誘因。

北美的研究者檢測了TLR4在哮喘中的多態(tài)性，在研究中對TLR4基因進行了篩選，共發(fā)現(xiàn)了29個SNP[35]。TLR4Asp299Gly等位基因與較高的革蘭陰性菌感染發(fā)生率有關，這可能有助于特應性兒童哮喘的發(fā)展[36]。TLR4Asp299Gly多態(tài)性還與兒童外周血單核細胞（PBMC）降低LPS誘導的IL-12（p70）和IL-10反應有關[37]。在攜帶TLR4Asp299Gly等位基因的人群中，特應性疾病的嚴重性升高，這表明TLR4Asp299Gly多態(tài)性導致先天免疫系統(tǒng)的反應降低，由此可見TLR4基因多態(tài)性與哮喘患者的特應性嚴重程度呈正相關[38]。除此之外，TLR2中的rs3804099和TLR4中的rs4986791也會導致罹患哮喘的風險增加[39]。

4.靶向TLR4及其信號通路治療哮喘的價值

目前哮喘治療的目的是盡量減少藥物不良反應，并實現(xiàn)良好的哮喘控制，然而對于重癥哮喘患者，目前還沒有最佳治療方法。免疫性疾病的抗免疫治療已由廣泛的抗炎治療轉為靶點治療，TLR4及其信號通路為哮喘的治療提供了多個新的潛在治療靶點，如TLR4拮抗劑、抗LPS多肽、抗HMGB1抗體等。

將TLR4拮抗劑TAK-242注入卵清白蛋白（OVA）誘導的小鼠腹腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)，TAK-242能夠降低小鼠鼻灌洗液中Th2細胞因子的水平，減少支氣管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒細胞和肺中Th2的數(shù)量[40]。沙格列汀是一種二肽基肽酶4抑制劑，已被廣泛應用于治療2型糖尿病。研究發(fā)現(xiàn)沙格列汀可以通過抑制TLR4/活性氧簇/NF-κB信號通路有效減輕OVA誘發(fā)哮喘小鼠的氣道炎癥，降低小鼠肺組織中的氧化應激以及NF-κB和TLR4的水平，這表明沙格列汀可能成為有效治療急性過敏性哮喘的潛在藥物[41]。白藜蘆醇是存在于葡萄皮、漿果和堅果中的一種植物多酚物質[42]。白藜蘆醇的有益作用已在肺纖維化、COPD、肺動脈高壓和其他肺部疾病中得到證實[43-44]。有研究表明，大劑量的白藜蘆醇通過抑制HMGB1/TLR4/NFκB途徑釋放的炎性細胞因子，減輕哮喘誘導的氣道炎癥和氣道重塑，這為白藜蘆醇作為潛在的新型哮喘治療方法提供了證據(jù)[45]。丹皮酚降低了小鼠TLR4的表達和NFκB的核易位，以及哮喘模型中p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）的磷酸化水平，通過抑制TLR4/NFκB和MAPK信號通路改善OVA誘導的哮喘[46]?？笻MGB1抗體能夠減少鄰苯二甲酸二異壬酯誘導的哮喘小鼠的Th2細胞因子、炎性細胞積累、黏蛋白產(chǎn)生，減輕氣道高反應性及肺組織損傷[47]。

四、結語

TLR4信號傳導通路作為機體免疫功能的一部分，與炎癥性和免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密不可分，在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。TLR4信號傳導通路存在多個治療哮喘的潛在靶點，針對TLR4信號傳導通路靶點的靶向治療，為哮喘的治療提供了一個新的研究方向，有著良好的研究前景。CC趨化因子受體5（CCR5）能夠調(diào)控T細胞和單核細胞/巨噬細胞系的遷移、增殖與免疫功能，但其與TLR4信號傳導通路的關系未見相關報道[48]。筆者課題組先前發(fā)現(xiàn)在哮喘小鼠體內(nèi)應用CCR5第二胞外環(huán)的拮抗短肽能有效減輕哮喘小鼠肺組織的炎癥程度，抑制TNF-α的表達[49]。TLR4信號傳導通路的激活能引起TNF-α、IL-4和IL-6等炎性細胞因子的釋放，CCR5拮抗劑是否能夠調(diào)控TLR4信號傳導通路緩解哮喘炎癥反應值得進一步探究。