黃琰 鄒雯 謝林艷 鄭蓉蓉 王一江

資料與方法

一、一般資料

前瞻性的選取2016年1月至2018年12月期間我院收治的哮喘病患者62名為觀察組，同期選取于我院體檢的健康者62名作為對(duì)照組。入選標(biāo)準(zhǔn)：1)哮喘患者的診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組制定的支氣管哮喘指南標(biāo)準(zhǔn)；2)患者年齡18～70周歲；3)哮喘病程大于10年者；4)近四周內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素(包括吸入類(lèi)糖皮質(zhì)激素)或者免疫抑制劑者；排除標(biāo)準(zhǔn)：1)合并肝腎功能不全者；2)合并免疫系統(tǒng)疾病者；3)哮喘合并其它肺部疾病如COPD者；4)存在其它組織器官感染需抗感染治療者；5)凝血功能障礙者；6)既往存在肺部外傷或者手術(shù)者；7)哮喘急性加重期或哮喘持續(xù)期。兩組患者均對(duì)此研究知情并簽署同意書(shū)，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

二、研究方法

1 研究對(duì)象外周血的抽取 獲取兩組研究對(duì)象空腹時(shí)晨外周靜脈血，量約6～8 mL，置抗凝管中，然后放入離心機(jī)，以3000r/分的速度離心，離心10 min，分離上清液，然后將上清液放入-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 miR-155含量檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)兩組研究對(duì)象外周血中miR-155含量水平，使用用Trizol 試劑從上述樣本中抽提總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)總RNA含量，A260 /A280值在1.8～2.0之間提示標(biāo)本方可用。然后對(duì)總RNA 進(jìn)行電泳，反轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。最后在熒光定量PCR儀上分別對(duì)miRNA-155和U6進(jìn)行擴(kuò)增。采用2-△△Ct計(jì)算miRNA-155 的相對(duì)表達(dá)量。

3 IL-35、IL-4及IL-6的監(jiān)測(cè)方法 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(酶聯(lián)免疫分析儀：Infinite F50,帝肯公司，瑞士；試劑盒，Santa公司 美國(guó))檢測(cè)IL-35、IL-4和IL-6的血清含量，具體操作方法按照試劑盒的方法操作。

三、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

結(jié) 果

一、兩組研究對(duì)象一般資料比較

本研究結(jié)果顯示，兩組研究對(duì)象在年齡、性別、高血壓、糖尿病等方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性(見(jiàn)表1)。

表1 兩組研究對(duì)象資料比較

二、兩組研究對(duì)象血清miR-155與IL-35水平比較

本研究結(jié)果顯示，觀察組患者血清miR-155高于對(duì)照組患者，而血清IL-35的含量則顯著低于對(duì)照組患者(P<0.05)，在一定程度上說(shuō)明了miR-155與IL-35參與了哮喘病的發(fā)生發(fā)展(見(jiàn)表2)。

表2 兩組研究對(duì)象血清miR-155與IL-35水平比較

三、 兩組患者研究對(duì)象血清IL-4及IL-6水平比較

本研究結(jié)果顯示，觀察組患者血清IL-4及IL-6含量水平則顯著高于對(duì)照組患者(P<0.05)，在一定程度上說(shuō)明了哮喘患者血清IL-4與IL-6水平高于健康體檢者，說(shuō)明炎癥因子參與了哮喘病的發(fā)生及發(fā)展(見(jiàn)表3)。

表3 兩組研究對(duì)象血清IL-4與IL-6水平比較

四、miR-155表達(dá)水平與炎癥因子IL-35之間以及IL-35與IL-4和IL-6的相關(guān)性

本研究結(jié)果顯示，哮喘病患者血清miR-155與IL-35的含量呈負(fù)向相關(guān)，同時(shí)IL-35與IL-4和IL-6呈負(fù)性相關(guān)性(P<0.05)，說(shuō)明了miR-155通過(guò)影響IL-35、IL-6及IL-4的表達(dá)水平參與哮喘病的發(fā)生發(fā)展(見(jiàn)表4)。

表4 IL-35與miR-155、IL-4及IL-6相關(guān)性分析

五、哮喘病患者發(fā)生的單因素及多因素Logistic回歸分析

本研究對(duì)本組哮喘病的發(fā)生進(jìn)行單因素分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，既往個(gè)人過(guò)敏史、家屬過(guò)敏史及哮喘史、miR-155升高及IL-35水平是哮喘病發(fā)生的危險(xiǎn)因素(見(jiàn)表5)。 多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，個(gè)人過(guò)敏史、家屬過(guò)敏史及哮喘史、miR-155升高及IL-35水平血清miR-155升高及IL-35水平含量下降是哮喘病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(見(jiàn)表6，表5)。

表5 哮喘病發(fā)生單因素分析

表6 哮喘病多因素 logisitic 回歸分析結(jié)果

討 論

哮喘病臨床特點(diǎn)包括發(fā)作性氣道平滑肌痙攣而導(dǎo)致氣道高張力，從而產(chǎn)生呼吸困難及并發(fā)氣道感染的風(fēng)險(xiǎn)[11]。目前緩解臨床氣道痙攣、激素類(lèi)藥物等對(duì)癥治療是該疾病的主要治療方法，但如何從分子甚至是基因的研究，是目前哮喘病研究的重點(diǎn)[12]。

miR-155作為最近的研究重點(diǎn)，其本身作為一種多功能的RNA，主要參與免疫系統(tǒng)的構(gòu)建。目前證實(shí)免疫系統(tǒng)紊亂及其炎癥反應(yīng)是哮喘病發(fā)生的主要病因，前者包括Th1(細(xì)胞免疫應(yīng)答)/Th2(分泌細(xì)胞因子介導(dǎo)體液免疫)失平衡，后者則包括IL-35的低表達(dá)及IL-4與IL-6因子的異常表達(dá)，且兩者之間也存在密切相關(guān)性[13]。故miR-155及IL-35的含量表達(dá)對(duì)研究哮喘的發(fā)生發(fā)展具有重要臨床意義。

本研究結(jié)果顯示，哮喘組患者血清miR-155的含量明顯高于健康者，而IL-35的含量低于對(duì)照組患者，其可能機(jī)制如下：miR-155通過(guò)限制IL-35的表達(dá)打破了Th1/Th2的平衡，促進(jìn)了Th2的活性，進(jìn)一步產(chǎn)生了IL-4及IL-6等炎癥因子的過(guò)度表達(dá)，最后對(duì)氣道產(chǎn)生了損傷，誘發(fā)支氣管哮喘的發(fā)生，而本研究結(jié)果也顯示了觀察患者炎癥因子IL-4及IL-6的表達(dá)高于對(duì)照組研究對(duì)象，初步證實(shí)了miR-155/IL-35途徑參與了哮喘的發(fā)生發(fā)展，與既往的研究結(jié)果一致[14]。

研究證實(shí)IL-35作為哮喘病免疫的第一反應(yīng)因子，其由T淋巴細(xì)胞分泌的IL-12家族成員，可通過(guò)影響Th2從而改變細(xì)胞因子的分泌(IL-4及IL-6)最終參與哮喘發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。本研究結(jié)果顯示IL-35與IL-4及IL-6存在負(fù)向相關(guān)性，可見(jiàn)IL-35具有可抑制IL-4及IL-6量的表達(dá)，從而調(diào)控體液免疫，減少組胺類(lèi)及炎性物質(zhì)的釋放，最終緩解臨床癥狀的潛在可能，既往存在類(lèi)似的報(bào)道[15-16]。

本研究結(jié)果進(jìn)一步分析顯示miR-155與IL-35的表達(dá)出在負(fù)性相關(guān)關(guān)系，同時(shí)Logistic分析顯示miR-155水平升高及IL-35降低是哮喘發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在一定程度上提示了miR-155在一定程度上限制了IL-35的表達(dá)，但具體生物學(xué)途徑的通路軸，對(duì)我們進(jìn)一步理解miR-155參與哮喘病的發(fā)生發(fā)展機(jī)理是十分必要的。

綜上所述，miR-155通過(guò)影響炎癥反應(yīng)及炎癥因子IL-35、IL-4及IL-6參與了哮喘的病理生理過(guò)程，具有重要的臨床研究意義。但本研究為單中心研究且樣本量少，需要多中心大樣本的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。