何雨笑 魯繼斌

肺癌是威脅人類健康的常見(jiàn)腫瘤之一。2015年中國(guó)國(guó)家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)2006-2011年肺癌患病率為1302/10萬(wàn)，男性84.6/10萬(wàn)，居惡性腫瘤第二位；女性45.6/10萬(wàn)，居惡性腫瘤第四位[1]。2017年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)發(fā)布肺癌死亡率在惡性腫瘤中居首位[2]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)作為一種腫瘤的“液體活檢”現(xiàn)已應(yīng)用于肺癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估以及化療療效評(píng)估等方面[3]。目前，早期肺癌主要依靠手術(shù)治療，通過(guò)肺癌的位置及浸潤(rùn)深度來(lái)選擇手術(shù)方式。對(duì)于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，原位癌和浸潤(rùn)癌的手術(shù)方式明顯不同，現(xiàn)有的手術(shù)方式主要包括亞肺葉切除和肺解剖切除。亞肺葉切除包括肺楔形切除和肺段切除，肺楔形切除是切除包括腫瘤在內(nèi)的部分肺臟，而肺段切除是切除腫瘤所在肺段；肺解剖切除即切除是切除整個(gè)肺葉甚至全肺。由于不同的術(shù)式手術(shù)時(shí)長(zhǎng)不同，切除的肺臟大小不同，導(dǎo)致患者術(shù)后恢復(fù)情況、術(shù)后肺活量、術(shù)后生存質(zhì)量以及術(shù)后生存時(shí)間也不盡相同。精準(zhǔn)且合適的手術(shù)方式可以提高患者的診療質(zhì)量以及生存質(zhì)量[4-7]。本研究通過(guò)對(duì)64例NSCLC術(shù)后患者的病理及CTCs結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，旨在研究術(shù)前循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量(circulating tumor cell，CTCs)與肺癌浸潤(rùn)深度之間的關(guān)系，從而在術(shù)前對(duì)患者肺癌的浸潤(rùn)深度進(jìn)行評(píng)估，選擇更加精準(zhǔn)的手術(shù)方式。

資料與方法

一、一般資料

1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)選取2018年7月-2019年6月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院胸外科行肺癌手術(shù)且術(shù)前行CTCs檢測(cè)的患者(2) 所有患者均知情并且簽署知情同意書，并同意參與到此次實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中;(3) 患者無(wú)重要器官損傷疾病; (4) 患者無(wú)其他合并并發(fā)癥。(5)患者未合并其他腫瘤

2 排除標(biāo)準(zhǔn) (1) 排除有放化療史患者; (2) 排除合并細(xì)菌感染患者；(3)患有其他腫瘤或腫瘤史的患者。共選取現(xiàn)有術(shù)后NSCLC患者64例。男34例，女30例，年齡49～78歲，平均年齡(60.8±7.2)歲。原位癌患者32例，男18例，女14例，年齡49～72歲，平均年齡(57.7±7.0)歲；非原位癌患者32例，男16例女16例，年齡52～78歲，平均年齡(63.8±6.2)歲。

3 儀器與試劑 ACD采血管(美國(guó) BD公司),低速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),磁力架(Pr omega),熒光顯微鏡(Ni kon),雜交儀(DAKO)。采用免疫磁珠陰性富集法的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)試劑采用其配套試劑(江蘇萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司)。

二、方法

1 血樣采集 統(tǒng)一采用ACD抗凝或EDTA抗凝(含抗凝劑)的5 mL真空采血管，采血后立即顛倒混勻8次，取樣量為4 mL。

2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集 輕柔顛倒混勻，取3.2 mL全血(含EDTA抗凝劑)(4Ml含ACD抗凝劑)至50 mL離心管中。補(bǔ)充CS1至45 mL。離心(650 g，室溫，5 min)，吸棄上清至約12 mL，輕搖離心管混勻沉淀細(xì)胞。將上述液體混勻后，加CS2至45 mL。將離心管置于垂直混勻儀混勻，室溫8～10 min(20 轉(zhuǎn)/ min)。按上述方法離心完全吸棄上清，補(bǔ)加200 μL CS1離心兩次后補(bǔ)加CS1 5 mL。洗滌磁微粒后將洗好后的磁微粒保存在試管架上。按每份150μL的比例將磁微粒緩慢加入上述樣本中，同時(shí)搖動(dòng)離心管以充分混勻。調(diào)節(jié)水平搖床至100～120rpm，將離心管以35°～40°角傾斜固定于搖床上，室溫?fù)u動(dòng)20～25 min。于新50 mL離心管中加入3 mL CS3，將上述樣本輕輕疊加到CS3頂層。然后用1 mL CS1清洗離心管壁，并將清洗液轉(zhuǎn)移至CS3頂層，配平后離心(300 g，室溫，5 min)。離心后，吸取結(jié)合了磁珠的白細(xì)胞沉淀以外的部分，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，補(bǔ)加CS1至14 mL，輕柔顛倒混勻后離心(950 g，室溫，5 min)，吸棄至300 uL，沿管壁加入1 mL CS1，輕柔吹打重懸沉淀細(xì)胞。將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至2 mL離心管，靠于磁力架2～3 min，將液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，架于15 mL離心管上端，離心(2070 g，室溫，3 min)，吸棄上清至約100μL，加入100μL CF1固定液，充分輕柔吹打混勻10次以上，涂片至20×20 mm2的標(biāo)本框中。將標(biāo)本自然干燥，建議使用無(wú)風(fēng)烘箱(26～33℃)。

3 imFISH 將干燥后的標(biāo)本進(jìn)行固定、老化、脫水處理，然后將探針加入標(biāo)本區(qū)，封片雜交。雜交后在標(biāo)本區(qū)加入CD45熒光抗體，避光孵育并加DAPI溶液，熒光顯微鏡下讀片。

三、判定標(biāo)準(zhǔn)

1 CTCs陽(yáng)性的判定[8]使用CEP8探針于熒光顯微鏡下讀片。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn): CTCs細(xì)胞為圓形、長(zhǎng)橢圓形，長(zhǎng)徑大于 10μm，細(xì)胞核所對(duì)應(yīng)的探針信號(hào)點(diǎn)大于等于 3個(gè)，并且未表達(dá)出白細(xì)胞表面抗原(紅圈標(biāo)記記)為一個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞。以 CTCs檢測(cè)數(shù)值大于等于 2個(gè)即為陽(yáng)性(見(jiàn)圖1、2)。

圖1 藍(lán)色為細(xì)胞核，橙紅色為探針信號(hào)位點(diǎn)，此圖無(wú)白細(xì)胞標(biāo)記 圖2 紅色為白細(xì)胞標(biāo)記

2 患者術(shù)后免疫組化病理結(jié)果 本研究免疫組化均由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科檢測(cè)并發(fā)布結(jié)果。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。資料行t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，以P<0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ROC數(shù)據(jù)分析，并計(jì)算其CTCs數(shù)值的臨界值，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、原位癌組和浸潤(rùn)癌組間各項(xiàng)指標(biāo)比較

原位癌組與浸潤(rùn)癌組比較，性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與原位癌組相比，浸潤(rùn)癌組年齡較大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與原位癌組相比，浸潤(rùn)癌組CTCs檢測(cè)數(shù)值較大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 原位癌組和浸潤(rùn)癌組間各項(xiàng)指標(biāo)比較

二、logistic回歸分析

為剔除混雜因素影響，將上述單因素分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入logistic回歸方程進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，CTCs為鑒別原位癌與浸潤(rùn)癌的獨(dú)立因素(見(jiàn)表2)。

表2 logistic回歸分析

三、CTCs計(jì)數(shù)與肺癌浸潤(rùn)深度間的關(guān)系

通過(guò)使用受試者工作曲線(ROC)分析CTCs與肺癌是否為浸潤(rùn)癌的相關(guān)性可以得出：當(dāng)Se=100%時(shí), Cutoff值：1.5, Se：1.000, Sp：0.219；當(dāng)Sp=100%時(shí), Cutoff值：3.5, Se：0.313, Sp：1.000；當(dāng) Se+Sp最大時(shí), Cutoff值：2.5, Se：0.625, Sp：0.937，由此可分析，CTCs數(shù)值為2.5個(gè)時(shí)為原位癌與浸潤(rùn)癌的最佳 Cutoff值，即當(dāng)CTCs≤2.5時(shí)，其腫瘤為原位癌的可能性大；當(dāng)CTCs>2.5個(gè)時(shí)，其腫瘤為浸潤(rùn)癌的可能性大(見(jiàn)圖3)。

圖3 CTCs計(jì)數(shù)與肺癌浸潤(rùn)相關(guān)性曲線圖

討 論

肺癌是世界上引起人類死亡的主要原因之一[9]。美國(guó)肺癌致死人數(shù)比乳腺癌、胰腺癌以及前列腺癌加起來(lái)的人數(shù)還要多[10]。早期肺癌的治療手段仍是手術(shù)治療，而手術(shù)方式的選擇大多基于肺癌的浸潤(rùn)深度，原位癌與浸潤(rùn)性肺癌的手術(shù)方式截然不同[11]。不同手術(shù)方式對(duì)患者術(shù)后的呼吸功能以及生存質(zhì)量有嚴(yán)重影響[12]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)，是Ashworth于1869年在血液中發(fā)現(xiàn)的一種與原發(fā)腫瘤細(xì)胞類似的細(xì)胞，并提出這個(gè)概念[13]。目前 CTCs 定義為由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。隨著腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，部分腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)，使腫瘤細(xì)胞通過(guò)結(jié)締組織間隙或因毛細(xì)血管破裂從而進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，形成CTCs[5]。CTCs檢測(cè)是一種新興的微創(chuàng)液體活檢技術(shù)(LB)，該領(lǐng)域中的近期刊物及新型技術(shù)證明了LB在腫瘤檢測(cè)中的重要性日益增加[14-18]。

已有大量研究證明，CTCs檢測(cè)已可以對(duì)腫瘤進(jìn)行早期診斷、化療效果以及術(shù)后生存時(shí)長(zhǎng)等方面的指導(dǎo)[19-27]，在早期診斷方面，Alfonso Fiorelli等人通過(guò)對(duì)54例肺癌及17例肺部?jī)尚阅[瘤的對(duì)比證明CTCs在肺癌的早期檢測(cè)中可以區(qū)分腫瘤的良惡性，其中20例惡性肺癌患者為原位癌，這表明在原位癌階段就可以通過(guò)CTCs檢測(cè)進(jìn)行早期診斷[19]；Hofman等人通過(guò)對(duì)COPD 168例患者及77例健康患者進(jìn)行CTCs檢驗(yàn)，其中5例COPD患者CTCs檢測(cè)為陽(yáng)性，隨訪五年后5例患者均發(fā)現(xiàn)肺癌[21]。這表明CTCs不僅可以在肺部腫瘤的早期進(jìn)行良惡性鑒別，而且可以檢測(cè)出影像學(xué)尚未發(fā)現(xiàn)的肺癌。在基因檢測(cè)方面，Yanagita等人對(duì)檢測(cè)出的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行EGFR突變堅(jiān)持，突變結(jié)果與患者的術(shù)后病理結(jié)果一致，這表明對(duì)于無(wú)法取得病理活檢的患者，可以通過(guò)CTCs檢測(cè)進(jìn)行EGFR突變的檢測(cè)，從而使患者得到及時(shí)的治療[25]。在肺癌轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)方面，Massagué等人CTCs可以通過(guò)外周血液的流動(dòng)，定植于腫瘤外器官?gòu)亩斐赡[瘤轉(zhuǎn)移，因此術(shù)后CTCs檢測(cè)仍為陽(yáng)性的患者有很高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[20]。在化療效果評(píng)估方面，Jay F. Dorsey等人通過(guò)對(duì)30名非小細(xì)胞肺癌患者化療前后循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在化療后[26]循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量會(huì)減少并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并表明可以通過(guò)化療前后循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量來(lái)判定化療的效果[26]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，隨著CTCs檢測(cè)值的增加，非小細(xì)胞肺癌更加傾向與浸潤(rùn)癌，這與Chen等人的研究是相符的，并且Chen等人還發(fā)現(xiàn)，Ⅰ/Ⅱ期患者的CTCs水平明顯低于Ⅲ/Ⅳ期患者，并且與性別、吸煙史及病理學(xué)類型無(wú)相關(guān)性[28]。在NCCN2009.V5非小細(xì)胞肺癌指南中指出，行亞肺葉切除的患者需要滿足一下條件之一：1)、組織類型為單純的原位癌；2)、CT顯示結(jié)節(jié)≥50%為毛玻璃樣；3)、影像學(xué)隨訪證實(shí)腫瘤倍增時(shí)間≥400天。對(duì)于毛玻璃樣組織超多50%的早期發(fā)現(xiàn)的肺癌患者來(lái)講，手術(shù)方式的選擇就十分重要并且也十分困難。本研究還表明，當(dāng)CTCs檢測(cè)值未超過(guò)2.5個(gè)時(shí)，其腫瘤為原位癌的可能行大。因此，對(duì)于上述通過(guò)影像學(xué)及隨訪時(shí)長(zhǎng)較難選擇手術(shù)方式的患者，術(shù)前行CTCs檢測(cè)就十分必要。若術(shù)前CTCs檢測(cè)值未超過(guò)2.5個(gè)時(shí)，便可選擇亞肺葉切除。亞肺葉切除相較于解剖切除而言，其手術(shù)時(shí)長(zhǎng)較短、術(shù)中出血量較少、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)較小、術(shù)后恢復(fù)周期較短，這大大提高了患者的治療質(zhì)量[29-30]。并且對(duì)于沒(méi)有手術(shù)意愿的早期肺癌患者，也可以通過(guò)CTCs檢測(cè)進(jìn)行隨訪讓患者明確自身腫瘤的具體情況。

通過(guò)研究結(jié)果我們知道，鑒別原位癌與浸潤(rùn)癌的臨界值為2.5個(gè)這并不是一個(gè)整數(shù)，而且CTCs檢測(cè)具有較高的真陽(yáng)性率(87.5%)，但是其也存在著一定的假陰性率，這都是由于CTCs的檢測(cè)方法不盡完善[31]，但現(xiàn)已有許多新型CTCs檢測(cè)技術(shù)已被研發(fā)，但尚未應(yīng)用于臨床，例如：Nano Velcro[32]，這種方法已可以能夠更多的捕獲和富集CTCs[33]。同理，GILUPI Cell Collector也可以更加精準(zhǔn)及有效的捕獲和富集CTCs[34]。由此可見(jiàn)，隨著技術(shù)的發(fā)展CTCs的檢測(cè)結(jié)果會(huì)更加精確，在腫瘤的診療也會(huì)更加精準(zhǔn)。