廖 梅

(1.嘉應(yīng)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，廣東 梅州 514031;2.廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與精準(zhǔn)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 梅州 514031)

錦燈籠，又名酸漿、掛金燈、紅姑娘，為茄科酸漿屬植物酸漿Physalis alkekengi L.var.franchetii (Mast.) Makino的干燥宿萼或帶果實(shí)的宿萼，其性寒，味苦，歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、利濕除熱、清肺治咳、利濕化痰和利尿通淋之功效，常用于治療急性、慢性氣管炎、咽炎和小便不利等癥，是藥食同源的常用中藥，收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部[1-4]。錦燈籠的化學(xué)成分主要包括酸漿苦素類、黃酮等多種成分[5-6]。其中該屬植物的專屬性特征成分酸漿苦素類化合物為其主要活性成分，研究表明該類成分具有顯著的抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗哮喘、防治糖尿病和利尿等活性[6-10]，具有很大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。目前對(duì)于錦燈籠的研究大多集中于對(duì)其酸漿苦素類成分的結(jié)構(gòu)和活性分析或者單個(gè)酸漿苦素類成分的含量測(cè)定[11]，具有一定的局限性。酸漿苦素類成分的活性顯著，現(xiàn)有文獻(xiàn)僅報(bào)導(dǎo)錦燈籠中酸漿苦素類成分含量低微，但是其含量究竟有多少并無(wú)確切數(shù)據(jù)。因此，建立錦燈籠中酸漿苦素類成分的含量測(cè)定方法將具有重要意義。鑒于酸漿苦素類化合物的基本結(jié)構(gòu)為13，14-裂環(huán)-16，24-環(huán)麥角甾烷，其本質(zhì)上仍然屬于甾體類化合物。文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果顯示總甾體類的含量測(cè)定主要包括硫酸-甲醇法[12]、香草醛-高氯酸法[13]、香草醛-硫酸法[14]、Liebermann-Burchard[15]等方法。課題組前期對(duì)以上幾種方法進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示硫酸-甲醇法最佳，因此本實(shí)驗(yàn)擬采用硫酸-甲醇法作為錦燈籠中總酸漿苦素類成分的含量方法。為了更好地評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地錦燈籠藥材質(zhì)量，彌補(bǔ)中國(guó)藥典對(duì)錦燈籠質(zhì)量控制的缺陷，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)收集24批來(lái)自不同產(chǎn)地的錦燈籠，采用硫酸-甲醇法建立錦燈籠中總酸漿苦素的含量測(cè)定方法，并利用該方法測(cè)定24批不同產(chǎn)地錦燈籠藥材飲片中總酸漿苦素的含量并評(píng)價(jià)其質(zhì)量?jī)?yōu)劣，為錦燈籠的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；MS103DU電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；MING-CHE 24UV超純水機(jī)(法國(guó)Merck Millipore公司)。

1.2 試藥

β-谷甾醇對(duì)照品(純度>98%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，分析純硫酸、冰醋酸和甲醇均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

24批錦燈籠藥材購(gòu)買(mǎi)自安國(guó)市藥材市場(chǎng)，經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院張正偉副主任中藥師鑒定為茄科酸漿屬植物酸漿Physalis alkekengi L.var.franchetii (Mast.) Makino的干燥宿萼(見(jiàn)表1)。

表1 錦燈籠樣品列表 Tab.1 List of selected samples of Physalis alkekengi

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

分別精密稱取6 g錦燈籠藥材粉末于圓底燒瓶中，加入75 mL甲醇，稱重，加熱回流提取30 min，放冷至室溫，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，過(guò)濾；濾渣重復(fù)上述步驟1次，合并2次提取液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，續(xù)濾液用甲醇稀釋5倍即得供試品溶液。

2.2 對(duì)照品貯備液的制備

精密稱取10 mg β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，加少量甲醇超聲使之完全溶解，繼續(xù)加甲醇定容至刻度線，配制成1 mg/mL的對(duì)照品貯備液，備用。供方法學(xué)考察和樣品測(cè)定用。

2.3 比色方法的確定

參考文獻(xiàn)[16]方法，精密吸取0.7 mL待測(cè)樣品溶液于比色管中，水浴揮干溶劑，精密加入硫酸-甲醇(9∶1)顯色劑1 mL，閉塞比色管并將其置于100℃下水浴反應(yīng)30 min后立即冰水浴30 min，再向比色管中加入5 mL冰醋酸，充分搖勻后于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.4 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

吸取1 mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，配制成0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液；分別精密吸取0.2 mg/mL對(duì)照品溶液0.7 mL和供試品溶液0.7 mL于比色管中，按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，充分搖勻后于200～1000 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描。結(jié)果見(jiàn)圖1，結(jié)果顯示對(duì)照品溶液和供試品溶液在386 nm有最大吸收，因此確定386 nm為本實(shí)驗(yàn)測(cè)定波長(zhǎng)。

注：a：對(duì)照品溶液；b：供試品溶液

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察

準(zhǔn)備7支1 mL的容量瓶，分別吸取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mL對(duì)照品貯備液于容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，制得0，0.1，0.2，0.4 mg/mL、0.6，0.8，1.0 mg/mL系列濃度的對(duì)照品溶液。分別吸取上述系列濃度的對(duì)照品溶液0.7 mL于比色管中，按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，在386 nm下測(cè)定吸光度。以對(duì)照品溶液濃度X為橫坐標(biāo)，吸光度值Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2，得回歸方程為Y=1.27X+0.0698，R2= 0.9981，說(shuō)明對(duì)照品在0.1～1 mg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液各0.7 mL于比色管中，平行制備6份，按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，在386 nm下測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示，6份溶液的吸光度值RSD值為1.96%，說(shuō)明該比色方法的精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液0.7 mL和3號(hào)供試品溶液0.7 mL，平行制備3份，按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，反應(yīng)完成后于冰水浴中分別經(jīng)過(guò)5，15，30，45，60，90，120 min后，再向比色管中加入5 mL冰醋酸，充分搖勻后于測(cè)定386 nm處的吸光度。結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果表明對(duì)照品溶液和供試品溶液的吸光度值在冰水浴終止反應(yīng)后15～45 min內(nèi)波動(dòng)較小，測(cè)定結(jié)果較穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)選擇冰水浴終止反應(yīng)后30 min測(cè)定吸光度。

注：a：對(duì)照品溶液；b：供試品溶液

2.5.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

稱取3號(hào)錦燈籠藥材樣品6 g，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，平行制備6份。按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，在386 nm下測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示，6份溶液的吸光度值RSD值為1.71%，表明該顯色方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

稱取已知含量的錦燈籠藥材粉末3 g，加入對(duì)照品溶液適量，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，平行制備3份。按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，在386 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示平均加樣回收率分別為99.5%，RSD值分別為0.5%，表明該方法準(zhǔn)確可行。

2.5.6 含量測(cè)定

稱取24批錦燈籠藥材粉末各10 g，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，平行制備3份。按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，在386 nm下測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示不同產(chǎn)地錦燈籠中總酸漿苦素的含量差異較大，含量最高值達(dá)6.81±0.08 mg/g，含量最低的僅為3.31±0.04 mg/g，二者相差一倍以上；其中2、3、11、14、15和23號(hào)樣品均來(lái)自四川地區(qū)，總酸漿苦素含量分布于3.31-4.37 mg/g，整體偏低；產(chǎn)自東北的1、6、7、8、9、12、13、18、19、20、21和24號(hào)錦燈籠藥材，其總酸漿苦素含量也存在較大差異，分布于4.46～6.81mg/g之間，整體含量高于其它產(chǎn)地。這些結(jié)果表明，總體上錦燈籠中總酸漿苦素含量低微，僅占生藥量的3.31‰～6.81‰；無(wú)論是相同產(chǎn)地還是不同產(chǎn)地，不同來(lái)源的錦燈籠飲片質(zhì)量并不一致。

表2 含量測(cè)定結(jié)果(n = 3) Tab.2 The content determination results(n = 3)

表2(續(xù))

3 討論

酸漿苦素是錦燈籠藥材中的主要活性成分，屬于甾體類成分，母體結(jié)構(gòu)中含有麥角甾烷，本身沒(méi)有特征紫外吸收，所以其總含量測(cè)定有一定難度。本實(shí)驗(yàn)利用甾體類成分在無(wú)水條件下，能與強(qiáng)酸發(fā)生各種顯色反應(yīng)，采用硫酸-甲醇顯色法來(lái)測(cè)定錦燈籠藥材中的總酸漿苦素的含量，為錦燈籠藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

錦燈籠常用的提取方法為超聲提取和回流提取，本實(shí)驗(yàn)前期通過(guò)對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、料液比三個(gè)因素進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)總酸漿苦素的溶出影響最為明顯，最終選取甲醇為提取溶劑、料液比為1∶12.5、提取時(shí)間為30 min的回流提取法對(duì)錦燈籠重復(fù)提取2次的樣品前處理方案。

預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇與酸漿苦素類成分經(jīng)顯色后的紫外吸收光譜一致，又因商品酸漿苦素類對(duì)照品經(jīng)常缺貨，因此本實(shí)驗(yàn)采用價(jià)廉易得的β-谷甾醇作為標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)測(cè)定錦燈籠中總酸漿苦素類成分含量，方法學(xué)驗(yàn)證可行。

錦燈籠主要分布在我國(guó)東北、西北、四川等地，綜合本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地錦燈籠藥材中總酸漿苦素含量具有明顯差異，其中四川地區(qū)含量最低，東北地區(qū)含量相對(duì)較高；也發(fā)現(xiàn)即使是來(lái)自同一產(chǎn)地東北，不同批次的錦燈籠中總酸漿苦素含量也存在著較大差異，出現(xiàn)這些現(xiàn)象的原因可能是：一可能是采收方式、干燥方式、貯藏時(shí)間等不同，造成其有效成分含量存在著差異，通過(guò)觀察購(gòu)買(mǎi)回來(lái)的錦燈籠藥材，也發(fā)現(xiàn)四川地區(qū)藥材的顏色最淺；二可能是由于市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的藥材來(lái)源眾多，好壞優(yōu)劣混雜其中，從而導(dǎo)致錦燈籠藥材質(zhì)量參差不齊。