莫湘濤,張依山,李勇軍,肖永杰

(1.河南省洛陽正骨醫(yī)院/ 河南省骨科醫(yī)院髖部損傷科, 鄭州 450046;2.河南省洛陽正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院風(fēng)濕科, 鄭州 450046;3.河南省洛陽正骨醫(yī)院/ 河南省骨科醫(yī)院檢驗科, 鄭州 450046;4.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八八醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科, 鄭州 475300)

骨關(guān)節(jié)炎屬老年人常見疾病,會出現(xiàn)局部滑膜炎癥反應(yīng),誘發(fā)關(guān)節(jié)處疼痛,影響患者生活質(zhì)量[1]。緩解關(guān)節(jié)炎、減少疼痛對于疾病意義重大。 硼替佐米(bortezomib,Bor) 在細(xì)胞增殖、凋亡,減少炎癥產(chǎn)生等免疫調(diào)節(jié)通路中發(fā)揮重要作用[2],可調(diào)節(jié)結(jié)腸炎癥反應(yīng)預(yù)防小鼠硫酸葡聚糖鈉引起的潰瘍性結(jié)腸炎從而緩解疾病[3]。 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎實驗中,抑制核因子κB( nuclear factor κB,NF-κB) 可減緩疼痛、炎癥和骨骼損傷[4]。 Bor 可能通過抑制NF-κB 途徑緩解骨關(guān)節(jié)炎從而影響疾病。 本研究通過白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β) 誘導(dǎo)ATDC5 細(xì)胞造成炎癥損傷,探究Bor 對ATDC5 炎癥損傷的影響,并初步探討其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗細(xì)胞

未分化的小鼠軟骨細(xì)胞株ATDC5 購自美國Sigma 公司,貨號:99072806。

1.2 主要試劑與儀器

Bor 購自西安楊森制藥公司, 批準(zhǔn)文號:H20170321;人重組IL-1β 購自美國PeproTech 公司,貨號:AF-211-11B-2;CCK-8 試劑盒、Annexin VFITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司,貨號分別為:C0037、C1062S;IL-1β ELISA試劑盒、一抗p-NF-κB、NF-κB(兔抗鼠)、B 細(xì)胞淋巴瘤/ 白血病-2 原癌基因(B cell lymphoma / lewkmia- 2, BcL-2) ( 兔抗鼠)、 BcL-2 相關(guān)X 蛋白( BcL-2 associated X protein, BAX) ( 兔抗鼠) 均購自美國abcam 公 司, 貨 號 分 別 為: ab9722、 ab16502、ab220803、ab32124、ab32503。 CO2培養(yǎng)箱購自山東博科科學(xué)儀器有限公司,型號:GSPX-50;酶標(biāo)儀購自賽默飛世爾科技有限公司,型號:Varioskan LUX;流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司, 型號:DxFLEX;蛋白凝膠成像儀購自美國BIO-RAD 公司,型號:GelDoc 2000。

1.3 實驗方法

1.3.1 ATDC5 細(xì)胞的處理

ATDC5 細(xì)胞培養(yǎng):實驗前DMEM/ F12 培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、100 萬U/ mL 青鏈霉素混勻制成DMEM/ F12 完全培養(yǎng)基置于4℃冰箱中待用。ATDC5 細(xì)胞加入DMEM/ F12 完全培養(yǎng)基于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞密度培養(yǎng)至70% ～80%時進行下一步實驗。 ATDC5 細(xì)胞處理:DMEM/ F12完全培養(yǎng)基稀釋Bor 制成0.25 mmol/ L Bor 待用;DMEM/ F12 完全培養(yǎng)基溶解IL-1β 制成100 mg / mL IL-1β 待用。 分別用0、5、15、25、35、45、55 nmol/ L Bor 處理ATDC5 細(xì)胞48 h,篩選無細(xì)胞毒性Bor 濃度范 圍, 分 別 用0、 1.0、 5.0、 12.5、 25.0 nmol/ L Bor[5]DMEM/ F12 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞1 h,添加10 μg / mL IL-1β[6]置于96 孔板和6 孔板共培養(yǎng);空白細(xì)胞(即0 nmol/ L Bor)為對照組。

1.3.2 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖情況

96 孔板中細(xì)胞Bor 和IL-1β 共培養(yǎng)48 h,添加CCK-8 試劑,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀檢測450 nm 處各孔細(xì)胞光密度(optic density,OD),設(shè)置6 個 重 復(fù)。 細(xì) 胞 存 活 率= OD450實驗組/ OD450對照組×100%。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況

6 孔板中細(xì)胞培養(yǎng)48 h,每孔收集1×106個細(xì)胞,按照Annexin V-FITC 試劑盒說明書,添加195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液、5 μL Annexin V-FITC 后輕輕混勻,然后加入10 μL 碘化丙啶染色液輕輕混勻。 流式細(xì)胞儀1 h 內(nèi)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.4 ELISA 檢測上清液中炎癥因子IL-1β 水平

6 孔板中細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)液,3000 r/ min 離心5 min 收集上清,分裝置于4℃冰箱待用。 嚴(yán)格按照IL-1β ELISA 試劑盒說明書操作,檢測上清液中IL-1β 水平。

1.3.5 蛋白免疫印跡檢測細(xì)胞中NF-κB、 BAX、BcL-2 蛋白水平

6 孔板中細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后,吸去培養(yǎng)液,每孔添加200 μL TRIzol,冰上裂解20 min,收集細(xì)胞混合液,13400 r/ min 離心15 min 收集上清即為細(xì)胞總蛋白,凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)膜;5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;對應(yīng)加入一抗NF-κB p65、BAX、BcL-2、GADPH,4℃孵育過夜;加入對應(yīng)的二抗,室溫孵育1 h;DAB 顯色試劑盒避光顯色;蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 24.0 進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()描述,多組比較用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用SNK-q法。當(dāng)P<0.05 時,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性實驗

CCK8 結(jié)果顯示,0、5、15、25 Bor 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 與0 nmol/ L Bor 組相比,35、45、55 Bor 組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)。 詳見圖1。

2.2 Bor 對細(xì)胞增殖的影響

與0 nmol/ L Bor 組相比,IL-1β 組細(xì)胞存活率降低(P< 0.05)。 與IL-1β 組相比, 1.0、 5.0、 12.5、25.0 nmol/ L Bor + IL-1β 組細(xì)胞存活率升高(P<0.05)。 見圖2。

圖1 各濃度Bor 處理細(xì)胞存活率情況Note.Compared with 0 nmol/ L Bor group, aP<0.05.Figure 1 Cell survival rate of Bor in different concentrations

2.3 Bor 對細(xì)胞凋亡的影響

與0 nmol/ L Bor 組相比,IL-1β 組細(xì)胞凋亡率升高(P< 0.05)。 與IL-1β 組相比, 1.0、 5.0、 12.5、25.0 nmol/ L Bor + IL-1β 組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。 見圖3A、3B。

2.4 Bor 對上清液中IL-1β 的影響

與0 nmol/ L Bor 組相比,IL-1β 組上清液中IL-1β 水平升高(P< 0.05)。 與IL-1β 組相比,12.5、25.0 nmol/ L Bor+IL-1β 組上清液中IL-1β 水平降低(P<0.05)。 見圖4。

2.5 Bor 對細(xì)胞中NF-κB 蛋白的影響

與0 nmol/ L Bor 組相比,IL-1β 組細(xì)胞中p-NFκB / NF-κB 水平升高(P<0.05)。 與IL-1β 組相比,1.0、5.0、12.5、25.0 nmol/ L Bor+IL-1β 組細(xì)胞中p-NF-κB / NF-κB 蛋 白 水 平 降 低(P< 0.05 )。 見 圖5A、5B。

2.6 Bor 對細(xì)胞中BcL-2、BAX 蛋白的影響

與0 nmol/ L Bor 組相比,IL-1β 組細(xì)胞中BcL-2蛋白水平降低(P<0.05);BAX 蛋白水平升高(P<0.05)。 與IL-1β 組相比,12.5、25.0 nmol/ L Bor +IL-1β 組細(xì)胞中BcL-2 蛋白水平升高(P< 0.05);25.0 nmol/ L Bor+IL-1β 組細(xì)胞中BAX 蛋白水平降低(P<0.05)。 見圖6A、6B。

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎患者會出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨進行性退變、滑膜炎癥、疼痛,受多因素影響,患者軟骨組織處細(xì)胞增殖、凋亡異常,影響患者健康[7]。 目前治療骨關(guān)節(jié)炎主要以改善關(guān)節(jié)功能、減輕炎癥從而緩解疼痛為主。 其中Bor 作為目前唯一應(yīng)用于臨床的蛋白酶體抑制劑,在多發(fā)性骨髓瘤中可影響腫瘤凋亡從而影響腫瘤生長[8];在炎癥性腸病小鼠中抑制NF-κB活性、抑制炎癥因子TNF-α 水平從而起到治療腸炎性腸病目的[9]。 Bor 能夠改善骨損傷從而治療早期骨關(guān)節(jié)炎[10]。

圖2 Bor 聯(lián)合IL-1β 處理細(xì)胞48 h 各組細(xì)胞存活率比較(± s, n= 6)Note.Compared with 0 nmol/ L Bor group, aP< 0.05.Compared with IL-1β group, bP<0.05.Figure 2 Comparison of cell survival rate in 48 h groups treated with bor and IL-1β

圖3 Bor 聯(lián)合IL-1β 處理各組細(xì)胞凋亡率比較(± s, n= 6)Note.A, Flow cytogram.B, Corresponding histogram.Compared with 0 nmol/ L Bor group, aP < 0.05.Compared with IL-1β group, bP < 0.05.Figure 3 Comparison of cell apoptosis rate of Bor and IL-1β treatment groups

圖4 Bor 聯(lián)合IL-1β 處理各組細(xì)胞上清液中IL-1β 水平比較(± s, n= 6)Note.Compared with 0 nmol/ L Bor group, aP < 0.05.Compared with IL-1β group, bP < 0.05.Figure 4 Comparison of IL-1 β levels in supernatant of cells treated with Bor and IL-1β

IL-1β 屬典型的致炎因子,可促進炎癥反應(yīng),在炎癥疾病中高表達(dá)可誘發(fā)炎癥機制,可反映細(xì)胞損傷炎癥程度[11]。 正常情況下關(guān)節(jié)滑液中存在微量IL-1β;骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織、滑液中能檢測到較高含量IL-1β,IL-1β 參與炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)[12],另外研究發(fā)現(xiàn)IL-1β 可促進新生大鼠骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞凋亡[13]。 BcL-2 是一種參與細(xì)胞凋亡基因,細(xì)胞正常狀態(tài)下可阻止線粒體中細(xì)胞色素C 釋放入胞漿之中,從而阻止細(xì)胞凋亡[14];BAX 是BcL-2 家族中研究最廣泛的促凋亡基因,與BcL-2 作用相反,可促進線粒體中細(xì)胞色素C 的釋放從而促進凋亡,而細(xì)胞色素C 從線粒體釋放到胞漿是細(xì)胞凋亡中關(guān)鍵一步[15]。 在骨關(guān)節(jié)炎患者中BcL-2 水平降低、BAX 水平升高從而促進細(xì)胞凋亡[16]。 本研究發(fā)現(xiàn),IL-1β 誘導(dǎo)ATDC5 細(xì)胞后,與0 nmol/ L Bor 組相比,IL-1β 組細(xì)胞存活率、細(xì)胞中BcL-2 蛋白水平降低,凋亡率、細(xì)胞中BAX 蛋白水平升高。 提示IL-1β可抑制ATDC5 細(xì)胞存活、促進其凋亡,誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥損傷,造成關(guān)節(jié)炎。 與IL-1β 組相比,(1.0、5.0、12.5、25.0)nmol/ L Bor+IL-1β 組細(xì)胞存活率、細(xì)胞中BcL-2 蛋白水平升高,凋亡率、細(xì)胞中BcL-2 蛋白水平降低。 提示Bor 可抑制ATDC5 細(xì)胞凋亡,促進BcL-2 蛋白水平表達(dá)、抑制BAX 蛋白水平表達(dá),增加細(xì)胞存活率,且隨著劑量增加,該作用逐漸增強,可能Bor 在細(xì)胞炎癥中發(fā)揮抗凋亡作用從而緩解疾病。

圖5 Bor 聯(lián)合IL-1β 處理各組細(xì)胞中NF-κB 蛋白水平比較(± s, n= 6)Note.A, Protein band diagram.B, Corresponding histogram.Compared with 0 nmol/ L Bor group, aP < 0.05.Compared with IL-1β group, bP < 0.05.Figure 5 Comparison of NF-κB protein levels in cells treated with Bor and IL-1β

圖6 Bor 聯(lián)合IL-1β 處理各組細(xì)胞中BcL-2、BAX 蛋白水平比較(± s, n = 6 )Note.A, Protein band diagram.B, Corresponding histogram.Compared with 0 nmol/ L Bor group, aP < 0.05.Compared with IL-1β group, bP < 0.05.Figure 6 Comparison of BcL-2 and Bax protein levels in cells treated with Bor and IL-1β

NF-κB 分子是廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子家族,參與應(yīng)激反應(yīng)、免疫、細(xì)胞增殖、炎性疾病和細(xì)胞凋亡等過程,是炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中分解代謝作用的中樞調(diào)節(jié)劑[17]。 當(dāng)細(xì)胞受炎癥因子刺激時可誘導(dǎo)IL-6、IL-8、環(huán)氧化酶2 等表達(dá),從而促進細(xì)胞損傷、促進炎癥反應(yīng)[18]。 IL-1β 激活表面的細(xì)胞因子受體導(dǎo)致NF-κB 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移向細(xì)胞核,從而促進炎癥介質(zhì)表達(dá),可通過抑制NF-κB 水平從而緩解IL-1β 引起的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)[19]。 而細(xì)胞凋亡與NF-κB 從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運密切相關(guān)[20]。 本研究發(fā)現(xiàn),與0 nmol/ L Bor 組相比,IL-1β組細(xì)胞中NF-κB 蛋白水平升高,提示IL-1β 可促進NF-κB 水平表達(dá),可能是IL-1β 促進NF-κB 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)表達(dá)促發(fā)炎癥反應(yīng)。 與IL-1β 組 相 比, ( 1.0、 5.0、 12.5、 25.0)nmol/ L Bor+IL-1β 組細(xì)胞中NF-κB 蛋白水平降低,且隨著Bor 劑量升高,細(xì)胞中NF-κB 水平逐漸降低,提示Bor 可直接作用緩解IL-1β 導(dǎo)致的NF-κB 水平升高現(xiàn)象,且隨著劑量升高,該作用效果明顯,從而降低炎癥因子水平表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡,實現(xiàn)對IL-1β 誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥損傷的保護作用。

綜上所述,Bor 對IL-1β 誘導(dǎo)的ATDC5 細(xì)胞可抑制細(xì)胞凋亡及炎癥因子表達(dá),實現(xiàn)對ATDC5 細(xì)胞的保護,可能是通過抑制NF-κB 途徑實現(xiàn)的。