王麗輝 金鄂 唐屹 羅京霞 鄭萍 曾真

(荊門(mén)市第一人民醫(yī)院心功能室，湖北 荊門(mén) 448000)

人類(lèi)基因組中有超過(guò)80%的基因被轉(zhuǎn)錄，但只有不到2%的基因最終編碼蛋白質(zhì)，這意味著大部分DNA序列被轉(zhuǎn)錄為非蛋白編碼的RNA。這些非編碼RNA中短鏈非編碼RNA如microRNAs，在潛在的疾病標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)等方面已經(jīng)進(jìn)行過(guò)深入的研究〔1〕。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)了一種新型的非編碼RNA，其長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸，被稱(chēng)為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)，并不具有編碼蛋白的能力，但近期研究表明，lncRNA能以RNA的形式在多種層面上(表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平)調(diào)控基因的表達(dá)，參與了劑量補(bǔ)償效應(yīng)、基因組印跡、細(xì)胞發(fā)育分化等重要生物學(xué)過(guò)程〔2〕。雖然對(duì)lncRNAs功能和作用機(jī)制的研究尚處于起步階段，但已有不少證據(jù)表明lncRNA在腫瘤、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，是當(dāng)前心血管疾病研究熱點(diǎn)之一〔3〕。研究表明，lncRNA參與調(diào)節(jié)心臟的發(fā)育〔4〕。心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄體(MIAT)位于染色體22q12.1上的心肌梗死易感位點(diǎn)，具有5個(gè)外顯子，且體外實(shí)驗(yàn)表明MIAT不編碼任何蛋白質(zhì)，屬于一種lncRNA。研究發(fā)現(xiàn)MIAT轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與心肌梗死易感性相關(guān)〔5，6〕，可能在轉(zhuǎn)錄后水平(剪接)調(diào)節(jié)基因表達(dá)〔7〕。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)是一種天然的HIF1α反義轉(zhuǎn)錄本，在心力衰竭患者中表達(dá)升高〔8〕，通過(guò)調(diào)節(jié)HIF1α的mRNA來(lái)調(diào)控新生血管生成，這對(duì)心肌缺血而言是一種重要的反饋。由此猜想lncRNAs可能作為急性冠脈綜合征(ACS)新的生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本研究擬探討ACS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞aHIF及MIAT的表達(dá)水平及其對(duì)ACS的診斷價(jià)值。

1 材料及方法

1.1研究對(duì)象 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者知情同意，收集荊門(mén)市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科住院部2016年9月至2017年2月確診的ACS患者91例，其中急性心肌梗死(AMI)42例，不穩(wěn)定型心絞痛(UA)49例，同時(shí)選取同時(shí)間段冠脈造影狹窄程度<50%的住院患者49例為對(duì)照組。所有患者行冠脈造影，根據(jù)病史、檢查結(jié)果、冠脈造影及手術(shù)報(bào)告并在2名經(jīng)驗(yàn)豐富的冠脈介入醫(yī)師協(xié)助下進(jìn)行分組。ACS診斷參照2014年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)(ACC)和美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(AHA)發(fā)布的心血管診療指南標(biāo)準(zhǔn)。排除急性感染、腫瘤、腦卒中、血液系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重肝、腎功能異常等患者。

1.2試劑 TRIzol?Reagent購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司；引物由上海生物工程有限公司合成；Epoch酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司；普通PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；LightCycler?480‖熒光定量PCR儀購(gòu)自瑞士Roche公司。人外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。

1.3標(biāo)本采集 所有患者在進(jìn)行冠脈造影前通過(guò)動(dòng)脈導(dǎo)管收集外周血3 ml至乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中。ACS患者采血時(shí)間均在胸痛發(fā)作后(5.2±1.1)h內(nèi)。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄(qRT)-PCR測(cè)定外周血細(xì)胞中l(wèi)ncRNA aHIF和MIAT水平 利用人外周血淋巴細(xì)胞分離液從人抗凝血中分離出單個(gè)核細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照人外周血淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)操作。采用TRIzol?Reagent試劑從外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取總RNA。Epoch酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA溶液D260/D280比值，計(jì)算RNA濃度及純度，取D260/D280比值在1.8～2.0者用于反轉(zhuǎn)錄。取500 ng RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配10 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為42℃ 15 min，98℃ 5 min，轉(zhuǎn)錄得到cDNA用于qRT-PCR反應(yīng)。以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，反應(yīng)條件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，60℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)。lncRNA-aHIF和MIAT的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列號(hào)

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析、秩和檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性分析、受試者工作特征(ROC)曲線分析。

2 結(jié) 果

2.1一般資料 對(duì)照組與ACS組的年齡、性別、吸煙史、糖尿病史、高血壓史比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，說(shuō)明兩組受試者的基礎(chǔ)水平基本一致。ACS組肌鈣蛋白(cTn)I、肌酸肌酶(CK)、肌酸肌酶MB同工酶(CK-MB)水平顯著高于對(duì)照組，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。AMI亞組與UA亞組的收縮壓、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、cTnI、CK、CK-MB水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，糖化血紅蛋白(HbA1c)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、舒張壓比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組受試者臨床資料比較

2.2各組受試者外周血單個(gè)核細(xì)胞中aHIF和MIAT的相對(duì)表達(dá)量 ACS組外周血細(xì)胞aHIF及MIAT表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，AMI亞組外周血細(xì)胞aHIF表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和UA亞組(P<0.05)。UA亞組外周血細(xì)胞MAIT表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和AMI亞組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組受試者外周血單個(gè)核細(xì)胞中aHIF和MIAT的相對(duì)表達(dá)量

2.3AMI亞組外周血細(xì)胞aHIF及MIAT水平與CK、CK-MB、cTnI水平的相關(guān)性 AMI亞組外周血細(xì)胞aHIF、MIAT水平與cTnI、CK-MB無(wú)相關(guān)性(P>0.05)；aHIF與CK呈弱正相關(guān)(r=0.317，P<0.05)，與MIAT無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

2.4外周單個(gè)核細(xì)胞aHIF、MIAT對(duì)ACS和AMI診斷的ROC曲線 aHIF對(duì)ACS及AMI診斷的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.791(95%CI：0.741～0.840，P<0.01)、0.838(95%CI：0.780～0.895，P<0.01)。以aHIF的約登指數(shù)對(duì)應(yīng)的最大切點(diǎn)0.422為最佳臨界點(diǎn)，aHIF對(duì)ACS的診斷臨界值為0.002 144 829(2-ΔΔCt值)，其敏感度為60.2%，特異度為82.0%。以aHIF的約登指數(shù)對(duì)應(yīng)的最大切點(diǎn)0.589為最佳臨界點(diǎn)，aHIF對(duì)AMI的診斷臨界值為0.002 282 892(2-ΔΔCt值)，其敏感度為59.0%，特異度為98.0%。見(jiàn)圖1、2。MIAT對(duì)ACS及AMI診斷的ROC曲線分析AUC均小于0.5，不考慮其對(duì)診斷有意義。

圖1 aHIF診斷ACS的ROC曲線

圖2 aHIF診斷AMI的ROC曲線

3 討 論

ACS是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病)中比較嚴(yán)重的類(lèi)型，發(fā)現(xiàn)并利用冠心病相關(guān)的生物標(biāo)志物更快速、準(zhǔn)確、早期識(shí)別冠心病高危人群與診斷ACS一直是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。對(duì)冠心病乃至ACS的診斷、病情評(píng)估、危險(xiǎn)分層、預(yù)后判斷等方面的生物標(biāo)志物的研究已比較成熟，對(duì)冠心病的診斷治療及管理發(fā)揮了重要總用。但須認(rèn)識(shí)到，單一的標(biāo)志物一般只反映疾病發(fā)生的某個(gè)環(huán)節(jié)，檢測(cè)具有局限性，因此國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者專(zhuān)家推薦多種生物標(biāo)志物聯(lián)合診斷冠心病，從多方面評(píng)估病情，為疾病治療提供有效靶點(diǎn)〔9〕。

近年來(lái)lncRNAs逐漸成為研究熱點(diǎn)，研究表明，lncRNAs不但在生理性心臟發(fā)育、心臟各類(lèi)型細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而且在心臟疾病，如心肌肥厚、心力衰竭、心肌梗死和心臟缺血再灌注損傷等病理性疾病發(fā)生發(fā)展中也起關(guān)鍵作用〔10〕。在冠心病方面，aHIF可以通過(guò)調(diào)節(jié)HIF1α信使RNA的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)節(jié)微血管生成，這對(duì)心臟缺血時(shí)非常重要。一項(xiàng)納入414例行經(jīng)皮冠脈介入術(shù)開(kāi)通犯罪血管的AMI患者的研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生AMI后，外周血細(xì)胞lncRNA的表達(dá)水平受到嚴(yán)格調(diào)控，且與左心室功能不全程度、心肌損傷標(biāo)志物、心血管疾病危險(xiǎn)因素相關(guān)；與健康受試者相比，心肌梗死患者外周血細(xì)胞aHIF表達(dá)升高〔11〕。本研究提示，aHIF可能對(duì)AMI的早期診斷有一定幫助。

Ishii等〔12〕使用52 608個(gè)基于單倍體的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)志物進(jìn)行大規(guī)模病例對(duì)照關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)位于染色體22q12.1上的心肌梗死易感位點(diǎn)，在此位點(diǎn)上分離出MIAT，且體外實(shí)驗(yàn)表明MIAT不編碼任何轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，是一種功能性RNA，同時(shí)通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MIAT轉(zhuǎn)錄區(qū)多個(gè)SNPs與心肌梗死易感性相關(guān)。MIAT主要存在于特殊的核小體中，與剪接因子類(lèi)固醇生成因子有高度親和力，可能在轉(zhuǎn)錄后水平(剪接)調(diào)節(jié)基因表達(dá)〔7〕。對(duì)成年雄性小鼠行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)制造AMI模型，對(duì)其進(jìn)行微陣列分析顯示MIAT1和MIAT2升高最顯著，分別為5倍和13倍，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這兩種lncRNA在心肌梗死后24 h達(dá)到高峰，且2 d后恢復(fù)至基線水平〔6〕。本實(shí)驗(yàn)與Vausort等〔11〕報(bào)道結(jié)果一致，考慮可能為升高機(jī)制及升高時(shí)間等方面的差異，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

已經(jīng)證明衡量外周血細(xì)胞中l(wèi)ncRNA水平對(duì)冠狀動(dòng)脈疾病高?；颊哂蓄A(yù)測(cè)價(jià)值〔13〕。本研究中僅CK與aHIF有較弱相關(guān)性，考慮原因可能為：(1)兩者存在位置不同，升高機(jī)制不一樣；(2)時(shí)間關(guān)系，導(dǎo)致外周血細(xì)胞中aHIF和MIAT與外周CK、CK-MB、cTnI外周血升高不同步。綜上，本次臨床研究證實(shí)了aHIF和MIAT在ACS患者外周血細(xì)胞中表達(dá)水平發(fā)生改變，其中aHIF表達(dá)水平升高，有望作為ACS診斷的潛在標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。