饒群仙 ，韋 苑，林少丹，彭永排，林榮春，何遠(yuǎn)橋，林仲秋，陳青松

（1.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院婦科腫瘤?？?，廣東廣州 510120；2.廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東廣州 510310；3.南昌大學(xué)實驗動物科學(xué)中心//南昌樂悠生物科技有限公司，江西南昌 330000）

卵巢癌作為女性最常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢［1］。因其缺乏典型癥狀及有效的篩查方法，難以實現(xiàn)早期診斷且具有種植和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點［2］。超過70.0%的卵巢癌直到發(fā)展到晚期才被診斷［3］。研究表明卵巢癌的5 年存活率僅為47.4%［4］，死亡率居婦科腫瘤第二位［5］，歷來被稱為“沉默的殺手”［6］。近年來研究報道晚期卵巢癌患者的最佳治療方法是以腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合紫杉醇+鉑類（卡鉑及順鉑為主）的一線新輔助化療（NACT）方案，腫瘤組織的異質(zhì)性與原發(fā)性或繼發(fā)耐藥是影響腫瘤療效的關(guān)鍵因素［7］。Vaughan 等［8］研究表明卵巢癌組織的化療敏感性、反應(yīng)預(yù)測因子和治療耐藥機(jī)制上存在的個體異質(zhì)性導(dǎo)致患者間的化療效果存在差異。近年來研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌的原發(fā)性耐藥的發(fā)生率約為15.0%～25.0%［9］，大多數(shù)卵巢癌治療后復(fù)發(fā)，并最終發(fā)展成耐藥［10］。因此，可以認(rèn)為卵巢癌的預(yù)后取決于是否及時診斷和系統(tǒng)的治療［11］，而指南推薦的化療方案無法解決患者個體異質(zhì)性以及耐藥性的難題。通過評估化療敏感性，可促進(jìn)個體化治療方案的優(yōu)化［12］，以克服和限制耐藥性的發(fā)展［13］，改善預(yù)后。目前國內(nèi)外積極開展腫瘤培養(yǎng)藥敏檢測，體內(nèi)藥敏檢測受技術(shù)復(fù)雜、價格昂貴、實驗周期長等因素影響，藥敏檢測主要以細(xì)胞生物學(xué)實驗等體外檢測為主。水凝膠包被的腫瘤組織培養(yǎng)藥敏檢測法（hydrogel embedded histoculture drug sensitivity test，HDST），簡稱HDST 技術(shù)，是借鑒國外先進(jìn)技術(shù)，研究探索出來一種新型腫瘤組織體外藥敏快速檢測方法，相對于四氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、組織塊培養(yǎng)法（histoculture drug response assay，HDRA）、三磷酸腺苷生物發(fā)光法（ATP tumor chemosensitivity assay，ATP-TCA）、基因分型、耐藥基因分析法等檢測方法，其在篩選腫瘤化療藥物上具有快速方便、經(jīng)濟(jì)實惠、可行性高等顯著特點。近年來，HDST 技術(shù)在我國開始臨床試驗，研究發(fā)現(xiàn)HDST 與咽喉腫瘤臨床化療方案的療效具有較好的相關(guān)性［14］，但該技術(shù)在國內(nèi)外卵巢癌的研究中仍處于空白階段。本研究應(yīng)用HDST 在卵巢癌個體化化療中的作用，探究HDST 在卵巢癌個體化新輔助化療方案選擇中的意義，以改善晚期卵巢癌患者的預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究回顧性分析2019 年10 月至2020 年1月于廣州市中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院婦科腫瘤?？剖罩蔚?1 例按照NCCN 指南推薦行新輔助化療的Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者，收集患者的社會人口學(xué)資料、病理學(xué)及手術(shù)記錄、影像學(xué)、腫瘤標(biāo)記物等臨床資料。本研究經(jīng)患者知情同意，并報送我院倫理委員會審批通過。研究對象按新輔助化療中HDST 藥敏有效率進(jìn)行分組，其中A 組（有效率<30.0%）、B 組（有效率30.0%～60.0%）、C 組（有效率≥60.0%）。分析不同組別的CA125、HE4、Fagotti評分指標(biāo)變化的差異，探討HDST 有效率與化療療效的關(guān)系。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者初次手術(shù)行腹腔鏡或剖腹探查術(shù)或穿刺活檢，組織學(xué)診斷符合2014 年FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期；②患者術(shù)后行3 次新輔助化療后再行間歇性腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)；③術(shù)中切除腫瘤組織行HDST 技術(shù)檢測；④治療前已完善胸片、腹部彩超、陰道超聲、CT、腫瘤標(biāo)記物等檢查；⑤所有患者心肝腎功能無明顯異常，無化療禁忌癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者除化療外接受其他類型的輔助治療，如靶向治療、放療、內(nèi)分泌治療等；②未完成3 次規(guī)范化新輔助化療療程。

1.3 HDST 技術(shù)

將腫瘤患者術(shù)中切除的腫瘤組織切割成微小組織塊，經(jīng)腫瘤標(biāo)本采集，腫瘤樣本處理，組織塊接種，藥物處理，敏感性檢測和結(jié)果分析，分析時根據(jù)吸光度值換算公式將孔板各孔的吸光度值進(jìn)行換算，進(jìn)而計算出每種藥物對腫瘤組織塊活性的影響。依據(jù)MTS 比色法藥物敏感性檢測判斷標(biāo)準(zhǔn)定義抑制率≥30.0%為有效藥物，抑制率<30.0%則判定為無效藥物。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣本的采集及處理 ①樣本的采集：手術(shù)切除下來的新鮮卵巢癌腫瘤樣本離體后盡快取材（15 min 以內(nèi)）。標(biāo)本離體后用預(yù)冷生理鹽水清洗，然后放入裝有預(yù)冷的組織保存液的離心管中。低溫2℃～8℃條件下4 h 內(nèi)運(yùn)輸至實驗室（切勿冷凍），存于細(xì)胞實驗室生物安全柜。②腫瘤組織處理：在細(xì)胞實驗室生物安全柜內(nèi)將腫瘤組織進(jìn)行活性鑒定、修整、消毒和清洗后分割成2 × 2× 2 mm 的組織塊，96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板每1 個孔內(nèi)放1 塊分割好的組織塊，細(xì)胞培養(yǎng)板放在冰板上預(yù)冷。

1.4.2 組織的體外培養(yǎng) ①組織塊接種：將一定量的水凝膠溶液（80 μL，96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板）加入到在含有組織塊的細(xì)胞培養(yǎng)孔中，淹沒全部組織塊，蓋上蓋子后放入37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳含量的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，待水凝膠凝固后，將培養(yǎng)板取出在生物安全柜里加入適量的組織培養(yǎng)基（100 μL/孔），再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②藥物處理：組織塊培養(yǎng)24 h 候后吸棄原來的組織培養(yǎng)基，加入含有測試藥物的新鮮組織培養(yǎng)基，每24 h 更換一次含有測試藥物的完全培養(yǎng)基。

1.4.3 藥物敏感性檢測 給藥3 d 后吸棄含藥培養(yǎng)基，用PBS 洗滌3 次，然后加入MTS 溶液孵育6 h，從裝有組織塊的細(xì)胞培養(yǎng)板中的每個板孔中吸取100 μL 溶液，把吸取的溶液加入新的細(xì)胞培養(yǎng)板的孔板中，使用酶標(biāo)儀檢測每孔的吸光度值。

1.4.4 藥敏檢測結(jié)果判定 根據(jù)算式A=abc，將各孔吸光度值進(jìn)行換算，計算每種藥物對腫瘤組織塊活性的影響。其中a 為吸光系數(shù)［單位為L/（g·cm）］，b 為光在樣本中經(jīng)過的距離（通常為比色皿的厚度，單位為cm），c 為溶液濃度（單位為g/L）。酶標(biāo)儀檢測490 nm 波長處的OD 值。藥物抑制率=（1-D藥物組/D對照組）×100%。實驗重復(fù)3 次，取平均值［14］。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）進(jìn)行描述，非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)［M（P25～P75）］描述，計數(shù)資料用例數(shù)n進(jìn)行描述。采用kappa檢驗一致性，采用Spearman′s 秩相關(guān)分析。所有檢驗均為雙側(cè)，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

本研究共收集11 例晚期卵巢癌患者。研究對象年齡位于55～69 歲之間，臨床分期以ⅢC 期為主。經(jīng)評估所有患者均可耐受化療，所有患者進(jìn)行剖腹/腹腔鏡探查/活檢，共10 例進(jìn)行了探查手術(shù)，以評估是否能進(jìn)行初次滿意腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，其中腹腔鏡探查6 例，開腹探查4 例，余1 例行腹水穿刺活檢后確診；病理類型以高級別漿液性癌為主，占9 例，低級別漿液性癌和低分化腺癌各1 例。隨著新輔助化療次數(shù)的增長，腫瘤標(biāo)志物CA125 與HE4 均呈現(xiàn)明顯的逐次下降趨勢。完成3 次新輔助化療后，患者CA125（U/mL）從化療前的1 181.2（564.3～2 750.0）降至25.5（14.9～63.6），HE4（pmol/L）從1 317.0（212.4～1 488.0）降至108.8（65.7～376.8），而化療后Fagotti評分從8.0（4.0～8.0）分降至2.0（0.0～2.0）分（表1）。

2.2 患者HDST 藥敏結(jié)果

11 例患者均嚴(yán)格按照NCCN 指南的推薦制定的以紫杉醇-鉑類聯(lián)合化療的新輔助化療方案。根據(jù)HDST 藥敏結(jié)果，11 例患者中有8 例在化療過程中使用HDST 結(jié)果中敏感性最高的推薦首選化療藥；6 例患者對選用的鉑類藥（順鉑或卡鉑）不敏感，1 例對紫杉醇不敏感。采用的化療藥中至少一半以上的藥物是有效的患者共6 人，其中僅3 例患者選用全部敏感的化療藥（表2）。

2.3 HDST 結(jié)果與臨床療效的一致分析

HDST 技術(shù)判定化療藥物是否有效的結(jié)果與患者實際的臨床療效結(jié)果的一致性較好（Kappa=1.000，P<0.05；表3）。HDST 技術(shù)在預(yù)測卵巢癌患者臨床療效方面的靈敏度、特異度和正確指數(shù)為100.0%?；贖DST的結(jié)果，對于化療過程中使用了HDST 提示不敏感（有效率<30.0%）的藥物的患者，預(yù)測臨床療效為無效的準(zhǔn)確率達(dá)100.0%。

表1 患者基本情況及臨床特征Table 1 Basic information and clinical characteristics of patients

2.4 HDST有效率與患者腫瘤指標(biāo)變化的相關(guān)分析

隨著新輔助化療次數(shù)的增長，A 組患者HE4、CA125 水平出現(xiàn)不降反升現(xiàn)象，其他組患者的腫瘤標(biāo)志物CA125 及HE4 的累積下降率均呈現(xiàn)逐次升高（圖1），8 例B、C 組（有效率≥30.0%）患者在完成3 次新輔助化療后腫瘤標(biāo)志物水平恢復(fù)正常，B、C 組患者腫瘤標(biāo)志物總下降率比A 組患者高1～2倍，且Fagotti 評分下降率超過70.0%（表4）。經(jīng)Spearman′s 秩相關(guān)分析，患者Fagotti 評分變化和HDST 有效率間存在顯著正相關(guān)（rs=0.678，P<0.05），而CA125、HE4 總下降率和HDST 有效率間無相關(guān)（P>0.05）。

3 討論

卵巢癌由于早期發(fā)病并無明顯典型臨床特征，難以實現(xiàn)早期診斷，不利于卵巢癌患者的治療。卵巢癌相關(guān)的高死亡率在很大程度上歸因于晚期診斷和耐藥性［15］。目前認(rèn)為晚期卵巢癌患者的最佳治療方法是以腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合以紫杉醇+鉑類（卡鉑及順鉑為主）為基礎(chǔ)的一線新輔助化療（NACT）方案［16］，以達(dá)到降低腫瘤負(fù)荷，提高手術(shù)效果，改善預(yù)后的目的。我們的研究發(fā)現(xiàn)晚期卵巢癌患者在按NCCN 指南推薦選擇一線“最佳”方案進(jìn)行的新輔助化療過程中出現(xiàn)耐藥的情況，6 例患者選用指南推薦卻自身不敏感的鉑類藥（順鉑或卡鉑），1 例患者對紫杉醇不敏感。這與前人研究報道的15.0%～25.0%的卵巢癌原發(fā)性耐藥率［9］，其中初治患者25.0%的原發(fā)性鉑類耐藥率［17］相比，本研究中一線鉑類藥的耐藥比例更高，這可能是與本研究樣本量較少相關(guān)。但無可否認(rèn)的是，由于耐藥性的存在，完全根據(jù)指南推薦制定的化療方案并不是患者最優(yōu)的“治療配方”。基于卵巢癌尚缺有效的早期篩查手段，有效的藥敏檢測技術(shù)以指導(dǎo)制定患者個體化化療方案，將明顯改善患者預(yù)后。

表2 患者HDST 結(jié)果及臨床用藥方案Table 2 Patients′HDST results and clinical medication regimen

表3 HDST 結(jié)果與臨床療效的一致性分析Table 3 Analysis of consistency between HDST results and clinical efficacy

表4 三組患者腫瘤標(biāo)記物及Fagotti 評分下降率變化情況Table 4 Changes of tumor markers and Fagotti scores in patients of the three groups（%）

圖1 三組患者CA125、HE4 及Fagotti 評分下降趨勢Fig.1 Declining trend of CA125，HE4 and Fagotti scores in patients of the three groups

本研究研究對象選擇11 例晚期（Ⅲ/Ⅳ期）行3 療程新輔助化療的卵巢上皮性腫瘤患者，新輔助化療臨床療效評估提示10 例有效，1 例無效。如上文所述，由于腫瘤異質(zhì)性和腫瘤微環(huán)境的影響，若不能恰當(dāng)?shù)睾Y選敏感度高的藥物治療及時控制病情進(jìn)展，不但會耽誤患者病情，延長病程，細(xì)胞毒性化療藥的不當(dāng)使用還可能導(dǎo)致不必要的毒副作用，誘導(dǎo)耐藥等不良預(yù)后。

為了探究HDST 技術(shù)在新輔助化療中應(yīng)用的可靠性，我們對基于患者HDST 藥敏情況判定的療效結(jié)果與臨床療效的一致性分析發(fā)現(xiàn)，HDST 藥敏是否有效與臨床療效判定結(jié)果之間一致性較好（Kappa=1.000，P<0.05），HDST 技術(shù)在預(yù)測卵巢癌患者臨床療效方面的靈敏度、特異度高。此外，比較3 組患者腫瘤觀察指標(biāo)變化情況（圖1），可能受樣本量的限制及Spearman′s 秩相關(guān)較低的檢驗功效的影響，本研究中尚未能證明腫瘤標(biāo)志物下降率與HDST 藥敏有效率間的相關(guān)性，但我們發(fā)現(xiàn)了有效率與Fagotti 評分指標(biāo)存在正相關(guān)（rs=0.678，P<0.05）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，無效組中有一例患者采用NCCN 指南推薦的多西他賽聯(lián)合順鉑或卡鉑化療方案進(jìn)行新輔助化療過程中出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展。HDST 結(jié)果顯示該患者對一線藥順鉑和卡鉑幾乎無效，而對紫杉醇和洛鉑敏感。因此，調(diào)整該患者化療方案為紫杉醇聯(lián)合洛鉑化療2 次后，腫瘤標(biāo)記物均降至正常，且隨訪半年無復(fù)發(fā)。從按指南推薦的方案化療后無效的化療療效，到基于HDST 結(jié)果調(diào)整方案化療后的病情改善，提示即使存在個體差異和腫瘤異質(zhì)性，根據(jù)HDST技術(shù)確實可為患者精準(zhǔn)治療提供依據(jù)，有助于臨床醫(yī)生在眾多一線化療藥物中篩選出病患的個體化精準(zhǔn)方案，改善患者預(yù)后。

值得一提的是，本研究也意外發(fā)現(xiàn)一例繼發(fā)耐藥的患者，其活檢時首次HDST 結(jié)果顯示對紫杉醇、卡鉑及順鉑等一線藥敏感度高于60.0%，3 次新輔助化療后，IDS 術(shù)中再次取病理組織進(jìn)行二次HDST 檢測發(fā)現(xiàn)一線化療藥的敏感度均降低，甚至已發(fā)展為對卡鉑及順鉑耐藥，而對洛鉑的敏感度也不佳（僅33.0%）。短短間隔3 個月的兩次HDST 檢測結(jié)果的變化提示晚期患者的耐藥性處于持續(xù)進(jìn)展，這與其他研究的結(jié)果一致。即大多數(shù)患初始治療良好，治療后會出現(xiàn)復(fù)發(fā)或最終發(fā)展成耐藥的情況［10］?；诨颊邉討B(tài)進(jìn)展的藥敏情況，僅一次HDST 檢測尚不能滿足臨床醫(yī)生全程掌控病情進(jìn)展的需求。因此，HDST 技術(shù)應(yīng)用于晚期卵巢癌患者新輔助化療中若能實現(xiàn)多次檢測，效果更佳。

HDST 技術(shù)的優(yōu)勢得益于其利用水凝包被的微組織培養(yǎng)技術(shù)提供的三維空間結(jié)構(gòu)，保持了組織的活性和腫瘤的微環(huán)境［18-19］，且在篩選腫瘤化療藥物上3～7 d 即可及時提供檢測結(jié)果，而建立人源腫瘤異種移植（patient-derived xenografts，PDX）模型就需要2～4 個月［19］。這不但彌補(bǔ)了目前PDX 等檢測耗時長、費(fèi)用高［7］缺點，同時其結(jié)果判讀方法借鑒成熟的MTT 法，藥敏結(jié)果與臨床化療方案療效相關(guān)性高［20］，檢測的結(jié)果符合臨床應(yīng)用的指南推薦化療方案，具有快速方便、經(jīng)濟(jì)實惠、可行性高等顯著特點。

基于HDST 的優(yōu)勢，在癌癥化療方案的篩選上可快速有效地提供一定的幫助。然而，HDST 也具有一定的局限性。作為一種體外化療藥物篩選方法，對于環(huán)磷酰胺這類需經(jīng)肝臟活化后發(fā)揮抗腫瘤作用的前體藥物的抗癌效果無法直接評估［14］。另外，PARP 抑制劑等靶向口服藥已用于卵巢癌維持治療［21］，而HDST 對于靶向口服藥物的檢測數(shù)據(jù)還在持續(xù)積累中。本研究還存在樣本少的缺陷，我們正在開展更大樣本的研究，同時對卵巢癌患者進(jìn)行長期隨訪及統(tǒng)計分析，以了解根據(jù)HDST 結(jié)果選擇化療方案的患者的生存優(yōu)勢，為今后卵巢癌患者尤其是原發(fā)性耐藥的卵巢癌患者依據(jù)藥篩結(jié)果進(jìn)行個體化精準(zhǔn)化療提供理論依據(jù)。

HDST 藥敏檢測法在卵巢癌的新輔助化療方案篩選上具有快速方便、經(jīng)濟(jì)實惠，結(jié)果與臨床療效一致的優(yōu)勢，有望為卵巢癌患者提供精準(zhǔn)的個體化化療方案。