謝顯彪，溫麗麗，呂東明，鄒雨桐，姚 浩，彭挺生

（1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨腫瘤科，廣東廣州 510080；2.廣東省骨科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510080；3.中山大學(xué)腫瘤防治中心麻醉科，廣東廣州 510060；4.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廣東廣州 510080）

上皮樣肉瘤是一種好發(fā)于青少年四肢及軀干的軟組織惡性腫瘤。本病組織來(lái)源不明，現(xiàn)多認(rèn)為其起源于原始間葉細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞具備向上皮及間葉方向分化能力，同時(shí)表達(dá)上皮標(biāo)志物如細(xì)胞角蛋白（cytokeratin）、上皮膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）及間葉標(biāo)志物如波形蛋白（vimentin）。臨床上該腫瘤表現(xiàn)為皮下或深部軟組織緩慢生長(zhǎng)的無(wú)痛性腫塊，易通過(guò)淋巴道及血道轉(zhuǎn)移，切除后易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差。目前手術(shù)是該病主要治療手段，患者五年生存率僅為60%～75%，復(fù)發(fā)率29%～85%，局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率22%～48%，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率27%～62.5%，肺是最常見(jiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位［1-2］。近年來(lái)研究者們發(fā)現(xiàn)約90%上皮樣肉瘤中存在特征性的整合酶相互作用分子1（integraseinteractor 1，INI1）表達(dá)缺失現(xiàn)象［3-4］，然而INI1 在上皮樣肉瘤中的作用及分子機(jī)制尚未闡明。因此，本研究主要是進(jìn)一步探討INI1 在上皮樣肉瘤中的作用及分子機(jī)制，為治療上皮樣肉瘤提供相應(yīng)理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

DMEM 培養(yǎng)基、2.5 g/L 胰酶、胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液、四甲基偶氮唑鹽（MTT）（廣州天駿生物科技有限公司，貨號(hào)：C11995、03-050-1A、10270-106、03-034-1B、A056），pTet-tTS質(zhì)粒（Clontech 公司），強(qiáng)力霉素（doxycycline，Dox）購(gòu)于江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司（貨號(hào)：M40613-5g），RIPA 裂解液、DMSO（廣州恒研生物科技有限公司，貨號(hào)：RIPA-EA0002、DMSO-1084ML100），INI1 抗體、Cytokeratin 抗體、Vimentin抗體、Leptin 抗體、Adiponectin 抗體、LPL 抗體、PPAR-γ抗體、CEBP-α抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（上海艾博抗生物科技有限公司，貨號(hào)：ab192864、ab756、ab92547、ab3583、ab133347、ab21356、ab45036、ab40764、ab6728），β-actin（CST公司，貨號(hào)：4970）。

1.2 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)

上皮樣肉瘤細(xì)胞株VA-ES-BJ、上皮惡性腫瘤細(xì)胞株A549 及MDA231、其他間質(zhì)肉瘤細(xì)胞株MFH 及SK-LMS、正常細(xì)胞NHDF 及HC-SMC 均購(gòu)于ATCC，在含有100 mL/L 胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃及體積分?jǐn)?shù)5%CO2下培養(yǎng)，2～3 d 傳代1 次。

1.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖速度

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，吹勻細(xì)胞，接種于96 孔板中，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，接種密度1×104個(gè)/孔。接種后24 h 分別更換成含Dox 1 mg/mL 及0 mg/mL 的培養(yǎng)基，連續(xù)7 d 進(jìn)行測(cè)定，加入20 μL 的5 g/L MTT 溶液后培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO，待結(jié)晶完全溶解后，在Bio-Rad550 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光度，繪制增殖曲線。

1.4 蛋白印跡法

將107個(gè)細(xì)胞收集于預(yù)冷的EP 管中，向EP 管中加入0.2 mL 的裂解緩沖液（7 mol/L urea，2 mol/L thiourea，4% CHAPS，65 mmol/L DTT，0.5 mmol/L EDTA，2 mmol/L PMSF）后反復(fù)吹打直至細(xì)胞完全裂解；室溫靜置30 min，4℃，15 000×g離心60 min，取上清即為總蛋白質(zhì)。按照碧云天的試劑盒說(shuō)明書抽提細(xì)胞漿蛋白。進(jìn)行SDS 電泳后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。1∶1 000一抗4 ℃孵育過(guò)夜。1∶5 000 二抗室溫孵育1 h，最后加入化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行檢測(cè)，X 線片暗室曝光，常規(guī)顯影定影。使用Image J 軟件進(jìn)行目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平的分析。

1.5 石蠟切片免疫組化

將組織切片脫蠟并水化；加入EDTA 修復(fù)液于微波中檔修復(fù)10 min；加入3%的過(guò)氧化氫滅活；加入5%正常血清37℃封閉30 min；加入一抗（1∶200）4 ℃濕盒孵育過(guò)夜，PBS 沖洗3 次，每次3 min；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min；滴加新鮮配制的DAB 顯色液10 min，水洗；蘇木素復(fù)染1 min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，水洗；脫水固定，滴加中性樹(shù)脂，加蓋玻片，自然晾干，在顯微鏡下觀察并采集圖像。染色結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，把染色腫瘤細(xì)胞強(qiáng)度分為0、1、2、3 四類，分別為無(wú)、弱、中、強(qiáng)信號(hào)。把染色腫瘤細(xì)胞百分比分為0、1、2、3、4 五級(jí)，分別對(duì)應(yīng)無(wú)染色、1%～10%、11%～50%、51%～80%及81%～100%。每個(gè)組織的得分是用染色值乘以百分比分類值來(lái)計(jì)算的，最后得分取兩位病理學(xué)家雙盲閱片下的平均分，陽(yáng)性等級(jí)：0 分為陰性，1～4 分為弱陽(yáng)性，5～8 分為陽(yáng)性，9～12 分為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.6 油紅染色

細(xì)胞爬片，用10%中性甲醛固定30 min，60%異丙醇浸洗，0.5%油紅O 60 ℃染色8 min，85%異丙醇洗3 min，蒸餾水洗，Mayer 蘇木素復(fù)染，水洗并甘油明膠封片，倒置顯微鏡下拍片。

1.7 INI1 Tet-on 誘導(dǎo)表達(dá)建立

將pTet-tTS 質(zhì)粒以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染VA-ES-BJ細(xì)胞，通過(guò)G418 篩選細(xì)胞克隆。以雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)篩選挑選高表達(dá)低背景的嚴(yán)密型Tet-on 細(xì)胞克隆。共轉(zhuǎn)染PBI-EGFP-INI1-HA/PTK-Hyg，通過(guò)潮霉素B 篩選并鑒定相關(guān)克隆。加入Dox 1 mg/mL 培養(yǎng)基培養(yǎng)后收集細(xì)胞提取蛋白做INI1 蛋白表達(dá)鑒定，同時(shí)取部分細(xì)胞于倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白GFP 的表達(dá)情況，鑒定出高表達(dá)低背景的細(xì)胞克隆擴(kuò)增凍存。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 21.0 軟件，圖形繪制使用GraphPad Prism 8.0。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述；兩組間比較，各組數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊時(shí)用t檢驗(yàn)；若呈正態(tài)分布但方差不齊時(shí)則采用秩和檢驗(yàn)。多組計(jì)量資料數(shù)據(jù)比較，符合正態(tài)分布及方差齊性的用one-way ANOVA 分析方法；組間兩兩比較用Tukey 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05（雙側(cè)），P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 INI1 在上皮樣肉瘤中表達(dá)缺失

通過(guò)Western blot 檢測(cè)正常細(xì)胞間葉細(xì)胞-成纖維細(xì)胞NHDF 及平滑肌細(xì)胞HC-SMC，上皮來(lái)源性惡性腫瘤-肺癌細(xì)胞株A549 及乳腺癌細(xì)胞株MDA231，上皮樣肉瘤細(xì)胞株VAESBJ 及Epi544，其他間質(zhì)來(lái)源惡性腫瘤-惡性纖維組織細(xì)胞瘤細(xì)胞株MFH 及平滑肌肉瘤細(xì)胞株SK-LMS，我們發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞株、上皮來(lái)源惡性腫瘤細(xì)胞株及其他間質(zhì)來(lái)源的肉瘤細(xì)胞株中均存在INI1 表達(dá)，僅僅在上皮樣肉瘤細(xì)胞株VA-ES-BJ、Epi544 中存在INI1 表達(dá)缺失的現(xiàn)象（P<0.05；圖1A）。免疫組化檢測(cè)上皮樣肉瘤臨床標(biāo)本發(fā)現(xiàn)91%標(biāo)本中存在INI1 蛋白表達(dá)缺失（圖1B）。

2.2 利用Tet-on 系統(tǒng)重建VA-ES-BJ 細(xì)胞中INI1 表達(dá)

首先轉(zhuǎn)染pTet-tTS 質(zhì)粒建立Tet-on 細(xì)胞，最后轉(zhuǎn)染PBI-EGFP-INI1-HA/PTK-Hyg，通過(guò)潮霉素B 篩選并鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染INI1 克隆，獲得5 及21號(hào)克隆細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)液加入Dox 1mg/ml 誘導(dǎo)后，可見(jiàn)5、21 號(hào)克隆細(xì)胞中INI1 表達(dá)顯著上調(diào)，而對(duì)照組INI1 表達(dá)仍為缺失（P<0.05；圖2）。倒置熒光顯微鏡下可以觀察到Dox 1mg/mL 誘導(dǎo)后5、21號(hào)克隆細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的綠色熒光（圖2）。

2.3 重建INI1 表達(dá)誘導(dǎo)VA-ES-BJ 細(xì)胞向脂肪方向分化

在加入Dox 誘導(dǎo)INI1 持續(xù)表達(dá)7 d 后，在普通倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，胞漿逐步豐富變，胞漿中出現(xiàn)大量空泡，細(xì)胞增殖速度明顯抑制（P<0.05，圖3A、B），同時(shí)上皮細(xì)胞標(biāo)記分子Cytokeratin 明顯下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記分子Vimentin依然大量表達(dá)（P<0.05；圖3C），進(jìn)一步檢測(cè)脂肪細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)瘦蛋白（Leptin）、脂聯(lián)素（adiponectin）和脂蛋白酯酶（lipoprotein，LPL）表達(dá)上調(diào)（P<0.05；圖3D）。這些結(jié)果提示重建INI1 表達(dá)可誘導(dǎo)上皮樣肉瘤細(xì)胞向脂肪方向分化。

2.4 重建INI1 誘導(dǎo)的VA-ES-BJ 細(xì)胞中脂肪形成轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)上調(diào)

圖1 INI1 在上皮樣肉瘤中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of INI1 in epithelioid sarcoma

圖2 重建VA-ES-BJ 細(xì)胞中的INI1 表達(dá)Fig.2 Reconstruction of INI1 expression in VA-ES-BJ cells

我們進(jìn)一步在VA-ES-BJ 細(xì)胞中檢測(cè)脂肪分化過(guò)程中的兩種脂肪分化過(guò)程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome prolif?erators-activated receptor-γ，PPAR-γ）及CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-α（CCAATenhancer binding proteinα，CEBP-α）的蛋白表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)隨著INI1誘導(dǎo)表達(dá)，PPAR-γ和CEBP-α表達(dá)均明顯上調(diào)（P<0.05；圖4A）。同時(shí)，重建INI1 后油紅染色出現(xiàn)顯著陽(yáng)性（圖4B）。上述結(jié)果表明INI1 可能通過(guò)上調(diào)脂肪分化中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ和CEBP-α來(lái)促進(jìn)上皮樣肉瘤細(xì)胞向脂肪方向分化。

3 討論

圖3 重建INI1 誘導(dǎo)VA-ES-BJ 細(xì)胞向脂肪方向分化的影響Fig.3 Reconstruction of INI1 induces adipocytic differentiation of VA-ES-BJ

本研究證實(shí)在上皮樣肉瘤細(xì)胞VA-ES-BJ 及Epi544 中INI1 蛋白表達(dá)缺失，在臨床標(biāo)本中91%存在INI1 蛋白表達(dá)缺失，與既往報(bào)道的基本一致。Hornick［5］等報(bào)道臨床上約90%上皮樣肉瘤中存在INI1 缺失現(xiàn)象。INI1 是ATP 依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合物SWI/SNF（switch/sucrose non-ferment?able）的核心蛋白亞基之一。SWI/SNF 復(fù)合物是一種進(jìn)化保守的多亞單位蛋白復(fù)合物，它能夠利用ATP 水解產(chǎn)生能量動(dòng)員核小體，通過(guò)滑動(dòng)、重建、分離、置換等作用介導(dǎo)染色質(zhì)解壓縮、重塑，從而調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，這種基因表達(dá)調(diào)解方式是表觀遺傳學(xué)重要調(diào)控機(jī)制之一［6-7］。INI1缺失可嚴(yán)重影響SWI/SNF 復(fù)合物活性，染色質(zhì)重塑異常，導(dǎo)致基因表達(dá)失控［8-9］。INI1 純合性缺失的小鼠在胚胎早期死亡，雜合性缺失小鼠中約20%在12 個(gè)月左右形成低分化或未分化軟組織肉瘤，這些腫瘤侵襲性極強(qiáng)，75%發(fā)生淋巴結(jié)或肺轉(zhuǎn)移［10］。Brenca等［11］證明上皮樣肉瘤細(xì)胞系VASEBJ 中INI1 表達(dá)的缺失是由于外顯子1 突變導(dǎo)致INI1 純合缺失所致，INI1 的重建導(dǎo)致細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移減少，并增加了對(duì)遺傳毒性應(yīng)激的敏感性。而Imura 等［12］發(fā)現(xiàn)AKT/mTOR 信號(hào)通路在兩個(gè)INI1 缺失的細(xì)胞系VAESBJ 和Asra-EPS 中持續(xù)激活，通過(guò)干擾mTOR 可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。由此可見(jiàn)，INI1在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起到重要的抑癌作用。INI1 的缺失通過(guò)對(duì)基因組穩(wěn)定性、細(xì)胞周期調(diào)控及其他信號(hào)通路相關(guān)靶基因的異常調(diào)控導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)化［13］。由此可見(jiàn)，INI1 在上皮樣肉瘤發(fā)病中具有重要作用。

圖4 INI1 上調(diào)脂肪形成轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)Fig.4 INI1 up-regulates expression of adipogenic transcription factors

鑒于INI1 的抑癌功能，本研究通過(guò)Tet-on 系統(tǒng)在上皮樣肉瘤細(xì)胞中重建INI1 表達(dá)。最新研究發(fā)現(xiàn)INI1 在胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化中扮演重要角色。Gresh 等［14］采用肝臟特異性INI1 敲除動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)70%與正常肝臟發(fā)育相關(guān)的基因下調(diào)，表明INI1 與肝細(xì)胞分化密切相關(guān)。在鼠3T3-L1 脂肪前體細(xì)胞及人間充質(zhì)干細(xì)胞中，干擾INI1 表達(dá)可抑制其向脂肪及神經(jīng)細(xì)胞方向分化［15］，鼠PC12細(xì)胞中干擾INI1 表達(dá)可抑制神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞向分化［16］。誘導(dǎo)表達(dá)INI1 后我們發(fā)現(xiàn)胞漿豐富，胞漿中出現(xiàn)大量空泡，細(xì)胞增殖速度明顯抑制，上皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物Cytokeratin 消失，脂肪細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物如瘦蛋白、脂聯(lián)素、脂蛋白脂酶表達(dá)上調(diào)，同時(shí)油紅染色出現(xiàn)特征性陽(yáng)性，提示腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)向脂肪方向分化。

既往有研究報(bào)道，棕色脂肪細(xì)胞和白色脂肪細(xì)胞分化都需要轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ和CEBP-α，它們?cè)诩?xì)胞向脂肪方向分化中起到關(guān)鍵作用［17-18］。脂肪生成刺激信號(hào)通過(guò)激活PPAR-γ誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞終末分化，隨后PPAR-γ和CEBP-α協(xié)同調(diào)控下游脂肪細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)［19］。特異性靶向抑制PPAR-γ基因可促進(jìn)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化，同時(shí)抑制其成脂防分化［20］。最新研究報(bào)道PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮和曲貝替定的聯(lián)用能促進(jìn)粘液樣脂肪肉瘤的終末脂肪分化［21］。本研究在上皮樣肉瘤細(xì)胞中重建INI1 后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞向脂肪方向分化，伴隨PPAR-γ和CEBP-α的上調(diào)，表明INI1 可能通過(guò)上調(diào)PPAR-γ和CEBP-α的表達(dá)，促使上皮樣肉瘤細(xì)胞向脂肪方向分化，刺激并維持脂肪細(xì)胞的表型。

綜上所述，上皮樣肉瘤組織起源于原始間葉細(xì)胞，同時(shí)具備上皮及間葉方向分化能力，腫瘤細(xì)胞中INI1 蛋白表達(dá)缺失。在上皮樣肉瘤細(xì)胞中重建INI1 表達(dá)，通過(guò)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ和CEBP-α表達(dá)，誘導(dǎo)其向脂肪方向分化，為該腫瘤提供了誘導(dǎo)分化治療的潛在靶點(diǎn)。