譚東明,魏杰,尹紅英
(1.江蘇護理職業(yè)學院藥學與中藥學院,淮安 223001;2.江蘇省淮安市淮陰區(qū)新渡鄉(xiāng)衛(wèi)生院,淮安 223300;3.江蘇省淮安市淮陰醫(yī)院,淮安 223300)
靈龍感冒膠囊收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第十二冊》[1],全方由龍膽、秦艽、防己、羌活、關木通、威靈仙和甘草7味中藥加工而成,具有解表清熱、祛濕止痛的功效,臨床上主要用于嚴重感冒、惡寒發(fā)熱、頭痛、身痛、四肢酸軟、小便發(fā)黃等病癥的治療?,F(xiàn)行質(zhì)量標準未對方中任何成分進行定量檢測,付成國等[2]僅對方中龍膽所含成分龍膽苦苷進行含量測定,中成藥復方制劑所含成分復雜,其臨床效果均為多種藥材共同協(xié)同的作用,單一成分的定量研究難以有效地評價中成藥復方制劑的質(zhì)量。筆者參考中藥質(zhì)量標志物[3-5]優(yōu)選原則,以“君”藥首選原則,兼顧“臣”“佐”“使”代表性物質(zhì),選取靈龍感冒膠囊方中君藥羌活所含主要活性成分紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素,君藥龍膽、臣藥秦艽所含主要活性成分龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷[6],佐藥防己[6]所含主要成分粉防己堿、防己諾林堿為定量測定研究對象,運用高效液相色譜(HPLC)梯度洗脫技術,對靈龍感冒膠囊中9種成分進行同步測定,報道如下。
1.1儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);METTLER TOLEDO電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司,感量:0.01 mg);KQ-250E型超聲波清洗器(上海量壹科學儀器有限公司)。
1.2試劑與藥品 龍膽苦苷(批號:110770-201716,含量:97.6%)、馬錢苷酸(批號:111865-201704,含量:97.4%)、獐牙菜苦苷(批號:110785-201404,含量:98.3%)、粉防己堿(批號:110711-201810,含量:99.6%)、防己諾林堿(批號:110793-201807,含量:98.3%)、紫花前胡苷(批號:111821-201604,含量:99.6%)、羌活醇(批號:111820-201705,含量:99.9%)、異歐前胡素(批號:110827-201812,含量:99.6%)對照品均來源于中國食品藥品檢定研究院;獐牙菜苷對照品(批號:14215-86-2,含量:98.0%)來源于南京森貝伽生物科技有限公司;乙腈、甲醇為色譜純,其他試劑為分析純;靈龍感冒膠囊(批號:180216,180504,180811)來源于湖北虎泉藥業(yè)有限公司。
2.1色譜條件 色譜柱:ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相A:乙腈-甲醇(1:1),流動相B:0.3%醋酸溶液,梯度洗脫(0~14.5 min,16.0%A;14.5~32.0 min,16.0%→35.0%A;32.0~47.5 min,35.0%→72.0%A;47.5~64.0 min,72.0%→81.0%A;64.0~75.0 min,81.0%→16.0%A);0~32.0 min在240 nm波長下檢測龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷[7-9],32.0~47.5 min在280 nm波長下檢測粉防己堿和防己諾林堿[6,10-11],47.5~75.0 min在315 nm波長下檢測紫花前胡苷、羌活醇和異歐前胡素[12];流速1.0 mL·min-1;柱溫30 ℃;進樣量10 μL。
2.2混合對照品溶液的制備 分別精密稱取龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素對照品適量,用甲醇分別制成9種單一對照品母液(龍膽苦苷7.312 mg·mL-1、馬錢苷酸0.598 mg·mL-1、獐牙菜苦苷0.934 mg·mL-1、獐牙菜苷0.316 mg·mL-1、粉防己堿1.988 mg·mL-1、防己諾林堿0.852 mg·mL-1、紫花前胡苷2.116 mg·mL-1、羌活醇0.492 mg·mL-1、異歐前胡素4.174 mg·mL-1);精密吸取9種單一對照品母液各2.5 mL,用甲醇制成混合對照品溶液(含龍膽苦苷0.3656 mg·mL-1、馬錢苷酸0.0299 mg·mL-1、獐牙菜苦苷0.0467 mg·mL-1、獐牙菜苷0.0158 mg·mL-1、粉防己堿0.0994 mg·mL-1、防己諾林堿0.0426 mg·mL-1、紫花前胡苷0.1058 mg·mL-1、羌活醇0.0246 mg·mL-1、異歐前胡素0.2087 mg·mL-1)。
2.3靈龍感冒膠囊供試品溶液的制備 取靈龍感冒膠囊適量,傾出內(nèi)容物,混勻,取0.2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加甲醇25 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲提取30 min,放冷,用甲醇補足減失質(zhì)量,搖勻,經(jīng)孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過,續(xù)濾液作為靈龍感冒膠囊供試品溶液。
2.4陰性對照溶液的制備 按照靈龍感冒膠囊質(zhì)量標準項下的處方和制備方法,分別制備缺羌活陰性樣品、缺龍膽、秦艽陰性樣品、缺防己陰性樣品,再按照“2.3”項下靈龍感冒膠囊供試品溶液的制備方法制備3種陰性樣品溶液。
2.5系統(tǒng)適應性實驗 分別精密吸取混合對照品溶液、靈龍感冒膠囊供試品溶液、羌活陰性樣品溶液、龍膽秦艽陰性樣品溶液、防己陰性樣品溶液各適量,依法進樣測定,記錄色譜圖。結(jié)果所測定各成分龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素色譜峰達到了較為理想的分離效果,分離度均>1.5,理論板數(shù)按所測各成分色譜峰計均>3500,陰性樣品對測定無干擾,混合對照品、供試品及陰性樣品色譜圖見圖1。
A.混合對照品;B.靈龍感冒膠囊供試品;C.龍膽秦艽陰性樣品;D.防己陰性樣品;E.羌活陰性樣品;1.龍膽苦苷;2.馬錢苷酸;3.獐牙菜苦苷;4.獐牙菜苷;5.粉防己堿;6.防己諾林堿;7.紫花前胡苷;8.羌活醇;9.異歐前胡素。
2.6含量測定方法學驗證
2.6.1線性關系考察 精密吸取“2.2”項下制備的9種單一對照品母液各2 mL,置于20 mL量瓶,用甲醇定容至刻度,制成線性關系混合對照品溶液Ⅰ;精密吸取線性關系混合對照品溶液Ⅰ各適量,用甲醇依次稀釋2,5,10,15,20倍,制成線性關系混合對照品溶液Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ和Ⅵ,按“2.1”項色譜條件進樣測定,以進樣濃度(C,μg)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸,得到9種成分線性回歸方程,結(jié)果見表1。
表1 靈龍感冒膠囊中9種成分線性關系實驗結(jié)果
2.6.2精密度實驗 取“2.2”項下制備的混合對照品溶液,在上述色譜條件連續(xù)進樣6次,記錄各成分色譜峰。結(jié)果龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素峰面積的RSD分別為0.51%,0.95%,0.82%,1.01%,0.64%,0.79%,1.68%,0.85%和0.66%。
2.6.3靈龍感冒膠囊供試品溶液穩(wěn)定性實驗 取同一份供試品溶液,在室溫下避光放置,分別在0,5,10,15,20,24 h進行測定,記錄各成分色譜峰。結(jié)果靈龍感冒膠囊供試品溶液室溫避光放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定,龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素峰面積的RSD分別為0.52%,0.97%,0.84%,1.07%,0.43%,1.76%,0.69%,0.83%和0.61%。
2.6.4重復性實驗 取同一批靈龍感冒膠囊,按照“2.3”項下靈龍感冒膠囊供試品溶液的制備方法平行制備供試品溶液6份,再按照“2.1”項色譜條件進行測定,記錄所測各成分的峰面積,計算各成分的含量。結(jié)果樣品中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素含量的RSD分別為1.56%,1.79%,1.68%,0.88%,1.18%,1.42%,0.21%,1.71%和1.24%。
2.6.5加樣回收率實驗 取已知含量的靈龍感冒膠囊9份,每份0.1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入另行配制的混合對照品溶液(含龍膽苦苷5.308 mg·mL-1、馬錢苷酸0.422 mg·mL-1、獐牙菜苦苷0.664 mg·mL-1、獐牙菜苷0.196 mg·mL-1、粉防己堿1.282 mg·mL-1、防己諾林堿0.538 mg·mL-1、紫花前胡苷1.366 mg·mL-1、羌活醇0.342 mg·mL-1、異歐前胡素2.728 mg·mL-1)0.5 mL3份、1.0 mL3份、1.5 mL3份,按照“2.3”項下靈龍感冒膠囊供試品溶液的制備方法制備加樣回收樣品溶液。在“2.1”項的色譜條件下進樣檢測,記錄所測成分的峰面積,計算回收率、平均回收率和RSD值,結(jié)果見表2。
2.7樣品測定 取靈龍感冒膠囊3批,分別按“2.3”項下靈龍感冒膠囊供試品溶液制備方法制備供試品溶液,在“2.1”項色譜條件下依法進樣檢測,記錄龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇和異歐前胡素的峰面積,以外標法計算所測9種成分的含量,檢測結(jié)果見表3。
3.1待測定成分的選擇 靈龍感冒膠囊由龍膽、秦艽、防己、羌活、關木通、威靈仙和甘草7味中藥加工而成,方中龍膽清熱燥濕,羌活解表散寒、除濕止痛,共為君藥;秦艽清濕熱、止痹痛、退虛熱,威靈仙祛風濕、通經(jīng)絡,合為臣藥;防己祛風止痛、利水消腫,關木通清心火、利小便,合為佐藥,甘草調(diào)和諸藥,為使藥。諸藥共奏,共達解表清熱、祛濕止痛的功效。方中羌活為傘形科植物羌活或?qū)捜~羌活的干燥根莖和根,主要含有香豆素類、有機酸類及揮發(fā)油類化合物,其中紫花前胡苷有鎮(zhèn)痛、抗炎、改善學習記憶等作用,羌活醇和異歐前胡素具有鎮(zhèn)痛、舒張血管、抗病毒活性作用[12];龍膽為龍膽科植物條葉龍膽、龍膽、三花龍膽或滇龍膽的干燥根和根莖,秦艽為龍膽科植物秦艽、麻花秦艽、粗莖秦艽或秦艽的干燥根,龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷等環(huán)烯醚萜類化合物為其主要活性成分,具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、保肝利膽、解痙鎮(zhèn)痛、增強免疫等多種活性[13];防己為防己科植物粉防己的干燥根,粉防己堿、防己諾林堿、氧化防己堿、粉防己堿D鹽酸鹽等雙芐基異喹啉類生物堿,為粉防己的主要活性成分[14]。筆者在本研究參考中藥質(zhì)量標志物優(yōu)選原則,選取君藥羌活主要活性成分紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素,君藥龍膽、臣藥秦艽主要活性成分龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷,佐藥防己主要成分粉防己堿、防己諾林堿為質(zhì)控指標,為靈龍感冒膠囊多組分評價模式提供數(shù)據(jù)支持。
表2 靈龍感冒膠囊中9種成分加樣回收率實驗結(jié)果
表3 3批靈龍感冒膠囊含量測定結(jié)果
3.2色譜條件的選擇 本實驗為考察不同的流動相對測定成分龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇和異歐前胡素分離效果、峰形和出峰時間的影響,對比考察了甲醇-水[6-7]、乙腈-水[6]、乙腈-0.1%磷酸溶液[6,8,10,15]、乙腈-0.3%冰醋酸溶液[6,12]、乙腈-甲醇(1:1)與0.3%冰醋酸溶液[6]等流動相,對比結(jié)果顯示乙腈-甲醇(1:1)與0.3%醋酸溶液為流動相時,所測各成分分離效果和峰形綜合效果最佳,出峰時間也較為理想。在此流動相基礎上,筆者對流動相的比例進行逐步摸索,最終確定采用乙腈-甲醇(1:1)與0.3%冰醋酸溶液為流動相,按照文中“2.1”色譜條件項下流動相比例進行梯度洗脫,實現(xiàn)對靈龍感冒膠囊中9種成分龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素的定量測定。
3.3提取條件的選擇 制備供試品時作者為考察不同提取溶劑對所測成分龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇和異歐前胡素提取率的影響,對比考察了甲醇[6-12,16-18]、50%甲醇、無水乙醇、50%乙醇等提取溶劑,結(jié)果表明,在同一提取方式相同提取時間條件下,以甲醇為提取溶劑時龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素的提取效果最佳,故以甲醇為提取溶劑;在此實驗結(jié)果的基礎上,筆者分別考察超聲和加熱回流兩種提取方式對所測成分龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇和異歐前胡素提取率的影響,結(jié)果表明,超聲提取和加熱回流提取所測各成分綜合提取率差異不大,可能與靈龍感冒膠囊的制備工藝有關,考慮實驗操作的便捷和實驗結(jié)果的準確度,選用超聲提取方式作為靈龍感冒膠囊供試品溶液制備方式;同時又對不同提取時間進行考察研究,最終確定采用甲醇超聲提取30 min作為靈龍感冒膠囊供試品溶液的制備方法。
3.4待測成分暫定含量的確定根據(jù) 3個批次靈龍感冒膠囊中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素平均含量的80%,暫定本品每克含龍膽、秦艽以龍膽苦苷計不得低于42.0 mg、以馬錢苷酸計不得低于3.4 mg、以獐牙菜苦苷計不得低于5.4 mg、以獐牙菜苷計不得低于1.5 mg;含防己以粉防己堿計不得低于10.1 mg、以防己諾林堿計不得低于4.3 mg;含羌活以紫花前胡苷計不得低于10.8 mg、以羌活醇計不得低于2.7 mg、以異歐前胡素計不得低于21.4 mg。
本實驗建立一種HPLC梯度洗脫法同時測定靈龍感冒膠囊中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、粉防己堿、防己諾林堿、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素的含量,所建立的方法簡便,準確,重復性好,可作為靈龍感冒膠囊的有效質(zhì)量控制方法。