李朋，徐浩，申茂磊，趙國立，錢彪，王勤章

(1.石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆石河子 832000；2.解放軍69235部隊衛(wèi)生隊，新疆奎屯 833200)

糖尿病是一種以胰島素分泌障礙和生物效應受損為特征的代謝障礙性疾病，其具體病因至今仍不完全明確。據(jù)調查中國成年人糖尿病患病率約為11.6%，且呈逐年升高的趨勢[1-2]。糖尿病膀胱病(diabetic cystopathy，DCP)是一種常見的糖尿病相關并發(fā)癥，在糖尿病人群中的發(fā)病率20%～80%[3]，主要臨床表現(xiàn)為膀胱敏感性下降、膀胱收縮功能障礙、最大膀胱容量增加、殘余尿量增多等，可伴尿急、尿失禁及反復尿路感染[4-5]，嚴重影響患者的工作和生活，越來越引起人們的重視。DCP的發(fā)病是一個復雜的、多因素的和時間依賴的過程[6]，其中肌源性、神經(jīng)源性和尿路上皮變化是DCP形成的主要原因[7-8]。豚鼠膀胱內有一種形態(tài)結構類似于胃腸道Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal，ICCs)，被稱為膀胱ICCs[9-10]。多項研究表明，膀胱ICCs可能是影響膀胱逼尿肌收縮活動的起搏器。前期研究證明高糖環(huán)境下膀胱ICCs膜上酪氨酸蛋白激酶(c-kit)受體表達降低，可導致ICCs數(shù)量減少和功能受損[11-12]。本研究通過以慢病毒為載體構建含干細胞白血病(stem cell leukemia，SCL)基因藥物的重組慢病毒，實現(xiàn)將SCL基因藥物成功導入豚鼠DCP膀胱，通過觀察SCL基因藥物導入后ICCs表面c-kit受體的表達，初步研究SCL基因藥物對豚鼠DCP膀胱ICCs的影響，旨在為臨床DCP的治療開辟一條新思路。

1 材料與方法

1.1動物 普通級荷蘭種健康雄性豚鼠60只，4～6個月齡，體質量200～300 g，普通環(huán)境飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制18～25 ℃，日溫差 ≤4 ℃，相對濕度40%～70%，工作照度≥200 lx，所有實驗動物均由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2018-0003，本研究全部內容已經(jīng)石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會審核批準。

1.2藥品與試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Solarbio公司，批號：615K0327)，SCL基因重組慢病毒載體藥物(上海吉凱恩公司)，熒光標記的羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1031)，鼠單抗c-kit(Santa公司，批號：sc-365504)，羊抗小鼠二抗(武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1051)，Western blotting試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司，批號：L00205C-1)。

1.3儀器與設備 RM2016輪轉式切片機(德國Leica公司)，TCSSP5激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)，GX51光學倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，DYCZ-24DN垂直電泳槽(北京六一儀器廠)，DYCZ-40電轉儀(北京六一儀器廠)。

1.4模型制備 60只健康雄性豚鼠適應性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h，按照200 mg·kg-1單次腹腔注射1% STZ溶液(將STZ溶于0.1 mol·L-1、pH值4.4新鮮枸櫞酸緩沖液配成)。常規(guī)飼養(yǎng)6周后剪耳法檢測隨機血糖，以連續(xù)4周隨機血糖≥16.7 mmol·L-1為標準篩選出糖尿病豚鼠。誘導成功動物模型繼續(xù)飼養(yǎng)2周后，>88.89%糖尿病豚鼠出現(xiàn)失代償期糖尿病膀胱病癥狀，即認為豚鼠DCP模型建立成功[13]。

1.5動物分組及給藥 將造模成功27只DCP豚鼠隨機數(shù)字表法分為3組：實驗組、陽性對照組和空白對照組，每組各9只。實驗前禁食禁水6 h，腹腔注射100 mg·mL-1水合氯醛200 mg·kg-1行麻醉，麻醉后將豚鼠四肢固定于操作臺上，充分暴露陰莖，消毒后鋪一次性洞巾，插入自制導尿管，排空膀胱及輸尿管尿液。實驗組經(jīng)尿道灌注的SCL基因重組慢病毒藥物(MOI為2×107U)0.2 mL；陽性對照組灌注不含SCL基因的慢病毒+磷酸鹽緩沖液(PBS)0.2 mL；空白對照組灌注PBS 0.2 mL。灌注后結扎尿管，使灌注液于膀胱中保存2 h。2 h后將豚鼠放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。

1.6培養(yǎng)ICCs 分別于灌注結束后第7，14，28 天，每次每組麻醉處死豚鼠3只，剖腹后迅速剪取膀胱，排盡殘余尿液，置于冰上PBS(含0.01 mol·L-1雙抗)培養(yǎng)皿中浸泡10 min；用PBS沖洗3次后，置于0.01 mol·L-1的PBS溶液中將其剪成碎塊1 mm3；將剪碎的膀胱放入10 mL離心管中用胰蛋白酶消融15～30 min，加入膠原酶V后繼續(xù)消融40 min；觀察膀胱組織不再是團塊狀后加入等劑量胎牛血清(FBS)終止消融；1000 r·min-1離心2 min后濾過收取濾液，繼續(xù)以1500 r·min-1離心5 min；離心后緩慢倒去上層懸液，留取下層白色團液，再加入新鮮DMEM，吹打單細胞懸液，并接種于共聚焦專用培養(yǎng)皿中；在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。更換培養(yǎng)基，將未貼壁的平滑肌細胞吸出，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至72 h后即可得到ICCs。

1.7ICCs鑒定 在6孔培養(yǎng)板各孔中放置無菌消毒的載玻片，用移液器將ICC懸液滴至載玻片中間位置，加入培養(yǎng)基1 mL，接種8 h，再加入培養(yǎng)基1 mL培養(yǎng)48 h后，取出細胞爬片，稀釋一抗和二抗(熒光素標記)，使工作濃度達1：100；1%PBS漂洗3次，每次15 min；室溫條件下用100%丙酮溶液固定15 min，風干后用PBS漂洗3次；采用0.03%過氧化氫(H2O2)溶液處理內源性過氧化物酶； PBS溶液漂洗3次；孵化30 min；緩慢吸取孵化液，與經(jīng)過稀釋的一抗融合，濕盒內室溫孵育2 h后置于-4 ℃冰箱繼續(xù)孵育48 h；PBS溶液漂洗3次；室溫下與二抗(熒光羊抗小鼠抗體)避光孵育60 min； PBS溶液漂洗3次；滴加50%甘油溶液于細胞爬片，用蓋玻片封閉，吸去滲出的甘油，風干后在激光共聚焦顯微鏡下觀察ICCs數(shù)量及分布特點。

1.8Western blotting檢測c-kit蛋白的表達 倒掉培養(yǎng)液，干燥培養(yǎng)瓶，每瓶細胞加入于4 ℃預冷的PBS液(0.01 mol·L-1，pH值7.2～7.3)3 mL。洗滌細胞并棄去洗液。重復2次以洗去培養(yǎng)液。棄凈PBS后把培養(yǎng)瓶置于冰上。加PMSF后搖勻置于冰上。加含PMSF的裂解液后于冰上裂解30 min，裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側，然后移至1.5 mL離心管中。4 ℃下12 000 r·min-1離心5 min，將離心上清液轉移到0.5 mL的離心管中，置于-20 ℃環(huán)境下保存。蛋白含量測定，電泳，轉膜，免疫反應，化學發(fā)光，顯影，定影，凝膠圖像分析。

2 結果

2.1成功建立豚鼠DCP模型 60只豚鼠經(jīng)單次腹腔注射STZ，飼養(yǎng)過程中死亡3只。常規(guī)飼養(yǎng)6周后以隨機血糖≥16.7 mmol·L-1為標準共篩選出52只糖尿病豚鼠，繼續(xù)飼養(yǎng)2周后，行尿動力學檢測豚鼠膀胱殘余尿量，以殘余尿量>10%膀胱容量為豚鼠DCP診斷標準，最終成功建立48個DCP豚鼠模型。

2.2ICCs形態(tài)觀察 體外分離的膀胱組織采用酶消融法培養(yǎng)72 h后，倒置顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)生長狀態(tài)良好ICCs，細胞呈梭型，胞核大，兩端發(fā)出軸絲2～4 條，鏡下可見單聚體與二聚體兩種形態(tài)的ICCs(圖1)，本研究以二聚體ICCs作為研究對象。

A 單倍體；B 二倍體

2.3免疫熒光 激光掃描共聚焦顯微鏡下可見標記的c-kit蛋白呈現(xiàn)綠色熒光，主要表達在ICCs細胞膜上。實驗組ICCs細胞熒光強度較其他兩組明顯增強，見圖2。

2.4c-kit蛋白表達結果 在7，14，28 d時實驗組c-kit蛋白表達較陽性對照組和空白對照組明顯增加(P<0.05)，陽性對照組較空白對照組c-kit蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。14 d時實驗組c-kit表達較7 d時明顯升高(P<0.05)，隨后在28 d時稍有下降(P<0.05)。其他兩組在3個時間段c-kit表達組間組內對比均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3)。

3 討論

通過單次腹腔注射足量STZ的方式損傷豚鼠胰島β細胞，使胰島素合成和分泌減少，形成糖代謝紊亂，參照文獻[14]中方法篩選出所需DCP豚鼠模型。通過構建重組慢病毒將SCL基因藥物轉染入DCP膀胱，于轉染后第7，14和28天取膀胱組織用于培養(yǎng)ICCs細胞。倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)單倍體ICCs和二聚體ICCs兩種細胞形態(tài)，二聚體ICCs特有的二聚體結構是高興奮性鈣波形成的結構基礎，與自律性較低的單倍體相比，二聚體ICCs更易在膀胱組織中發(fā)揮起搏及興奮傳遞作用[15]，且二聚體ICCs能特異性表達c-kit，可能是激發(fā)逼尿肌興奮活動的始動者，起著起搏作用[16]，因此在本研究中以二聚體ICCs作為研究對象。

A.實驗組；B.陽性對照組；C.空白對照組。

①與實驗組比較，P<0.05。

c-kit蛋白是ICCs細胞膜表面的特異性標志，是原癌基因c-kit所編碼的跨膜酪氨酸激酶受體蛋白，位于人染色體4q12-13處[17]。c-kit受體和細胞外環(huán)境中的干細胞因子(stem cell factor，SCF)結合后SCF/c-kit信號通路被激活[18]，通過啟動細胞內Ras、Raf、絲裂原活化的蛋白激酶和磷脂酰肌Ⅲ激酶等信號轉導通路，將信號傳入胞核，從而調控多種基因的表達，對ICCs的發(fā)育、分化及表型維持具有重要意義[19]。前期研究表明導致DCP形成的一個主要原因是高糖環(huán)境下ICCs不斷萎縮或數(shù)量減少，細胞表面c-kit蛋白和mRNA表達下降，造成SCF/c-kit信號通路傳輸功能受損，進而導致膀胱敏感性下降、排尿階段逼尿肌收縮性減弱、膀胱容量升高、膀胱殘余尿量變多等[20-21]。SCL基因是c-kit上游重要的調控基因，可作用于c-kit基因的啟動子，極強地促進c-kit的表達，并使其對SCF反應性恢復正常，有助受損的SCF/c-kit信號通路恢復[22-23]。據(jù)此推測：以慢病毒為載體，構建SCL基因重組慢病毒藥物，以轉染的方式將SCL基因經(jīng)尿道導入豚鼠DCP膀胱中，SCL基因藥物使DCP膀胱受損ICCs表面c-kit的表達升高，同時SCF/c-kit信號通路被修復，最終可使ICCs細胞功能得到恢復。

在本實驗中，SCL基因藥物經(jīng)重組慢病毒轉染入實驗組豚鼠DCP膀胱，分別于轉染后第7，14，28天，在激光共聚焦顯微鏡下觀察3組ICCs細胞c-kit受體的表達，結果表明實驗組ICCs熒光強度較其他兩組明顯增強，陽性對照組和空白對照組ICCs熒光強度對比無明顯差異。Western blotting檢測結果顯示第14天時SCL重組慢病毒藥物轉染效果較好，實驗組c-kit表達與其他兩組相比明顯增高，陽性對照組和空白對照組c-kit表達對比差異無統(tǒng)計學意義。實驗結果與我們之前的推測基本一致。

綜上所述，SCL基因藥物導入豚鼠DCP膀胱中，能夠上調受損ICCs細胞c-kit受體的表達，進而使SCF/c-kit信號通路得到修復，有利于ICCs細胞起搏功能的恢復，也為臨床DCP的治療提供一個新思路。