楊波，胡有志，張峰，肖金鳳，胡勇

(湖北省中醫(yī)院心內(nèi)科，湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430061)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)誘導(dǎo)的心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)是造成人類死亡的重要原因。據(jù)《中國(guó)心血管病報(bào)告2017》數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)目前CVD患者約為2.9億例，同時(shí)，我國(guó)每年死于CVD約350萬例，占總死亡原因41%，居各種疾病之首[1]。目前認(rèn)為AS是一種脂質(zhì)沉積于血管壁的慢性炎癥疾病[2]，在AS病理過程中，除了血管局部的炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)沉積外，氧化應(yīng)激也在AS發(fā)生、發(fā)展過程中起到至關(guān)重要的作用。

白楊素是一種從紫藏科植物木蝴蝶中提取的天然黃酮類化合物，具有抗癌、抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)和降低血糖等廣泛的藥理學(xué)作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，白楊素能顯著減輕過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管間粘附分子-1(vascular adhesion molecule-1，VCAM-1)基因表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞一氧化氮(nitric oxide，NO)合成[3]。筆者在本實(shí)驗(yàn)擬通過高脂飲食誘導(dǎo)的家兔AS模型觀察和分析白楊素在整體水平下對(duì)AS的干預(yù)作用及機(jī)制，為充分挖掘白楊素藥理學(xué)作用提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雄性日本大耳白兔24只，普通級(jí)，體質(zhì)量(2.8±0.2)kg，購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018，合格證編號(hào)：42000600004459，月齡3～6個(gè)月，單獨(dú)飼養(yǎng)于兔籠內(nèi)，環(huán)境溫度20～24 ℃，相對(duì)濕度30%～50%，每日12 h明暗周期照明，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，開始實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑及儀器 白楊素，貨號(hào)：YB-0284，純度≥90%(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)，總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)，總超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)、二喹啉甲酸(bicin-choninic acid，BCA)蛋白濃度及蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)，RIPA裂解液(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)，Von Kossa染色試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)，油紅O及二氫乙啡啶(dihydroethidium，DHE，Sigma-Aldrich公司)。

1.3儀器 H1650離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司)，Allegra 64R低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)，1510酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)，BX41多功能顯微鏡(日本Olympus公司)，RM2235石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，CM1860冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，BGZ-70電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)。

1.4分組與給藥 利用SPSS18.0版統(tǒng)計(jì)軟件將24只家兔隨機(jī)分成3組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和白楊素組，每組8只。正常對(duì)照組給予普通飼料，模型對(duì)照組和白楊素組給予高脂飼料(含豬油5%和膽固醇1%)。4周后，白楊素組除給予高脂飼料外，每天灌胃給予白楊素25 mg·kg-1，白楊素采用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)混懸助溶。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組則灌胃給予等體積0.5%CMC-Na混懸液，每天1次，共8周。實(shí)驗(yàn)過程中，每周稱定體質(zhì)量1次，按體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量。

1.5血脂水平測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天，禁食12 h，耳緣靜脈取血，離心(3500×g，10 min)分離血清，血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟執(zhí)行。

1.6病理學(xué)觀察 水合氯醛過量麻醉處死家兔，分離主動(dòng)脈，4%多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋，切片厚度6 μm，HE和Von Kossa染色步驟嚴(yán)格按染色試劑盒說明書執(zhí)行。部分主動(dòng)脈經(jīng)OCT包埋，冰凍切片機(jī)切片，厚度8 μm，進(jìn)行油紅O染色。上述切片在多功能顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.7主動(dòng)脈超氧陰離子(superoxide anion，O2·-)水平測(cè)定 主動(dòng)脈O2·-水平測(cè)定通過DHE熒光染色半定量法測(cè)定，冰凍切片用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次5 min，DHE(10 μmol)室溫避光染色10 min后，PBS清洗切片3次，每次5 min，抗熒光淬滅封片劑封片，多功能顯微鏡拍照，Image J軟件(1.8.0)計(jì)算熒光強(qiáng)度。

1.8主動(dòng)脈MDA濃度及SOD活性測(cè)定 RIPA裂解液冰浴勻漿主動(dòng)脈，勻漿液在4 ℃條件下離心(12 000×g，5 min)，取上清液待測(cè)，MDA濃度及SOD活性測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。此外，用BCA試劑盒測(cè)定上清液中蛋白濃度，用于校正MDA濃度及SOD活性。

2 結(jié)果

2.1白楊素顯著改善AS家兔血清脂質(zhì)紊亂 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組家兔血清TC、TG和LDL-C水平顯著升高(P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，白楊素組血清TC、TG和LDL-C水平顯著降低(P<0.05)，HDL-C水平顯著升高(P<0.05)(圖1)。

2.2白楊素顯著減輕AS家兔主動(dòng)脈組織病理學(xué)變化 HE染色顯示：正常對(duì)照組家兔主動(dòng)脈壁的各層結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜光滑，中膜彈力纖維在正常狀態(tài)。模型對(duì)照組可見明顯內(nèi)皮部分細(xì)胞脫落，內(nèi)中膜呈明顯增厚現(xiàn)象，且凸向管腔內(nèi)。此外，可見大量的平滑肌細(xì)胞移行至內(nèi)膜下形成纖維帽，內(nèi)膜下的泡沫細(xì)胞及沉積的脂質(zhì)形成了脂質(zhì)核心，部分可見鈣化。外膜上可見有炎性細(xì)胞聚集于此。白楊素組中內(nèi)膜尚光滑，中膜增厚，泡沫細(xì)胞明顯減少，未見脂質(zhì)核心形成(圖2)。

油紅O 染色顯示：正常對(duì)照組家兔主動(dòng)脈壁脂質(zhì)沉積不明顯。模型對(duì)照組可見明顯主動(dòng)脈壁脂質(zhì)沉積現(xiàn)象，尤其在內(nèi)膜層。白楊素組主動(dòng)脈壁脂質(zhì)沉積明顯減少(圖2)。

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

Von Kossa染色顯示：正常對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)染色均勻，呈淡紅色，未見黑色顆粒狀沉淀。模型對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)膜下可見大量的黑色結(jié)節(jié)狀沉淀，說明存在大量鈣化灶。而白楊素組中主動(dòng)脈內(nèi)膜下僅見散在的黑色結(jié)節(jié)，說明存在輕微的動(dòng)脈鈣化灶(圖2)。2.3白楊素顯著降低AS家兔主動(dòng)脈O2·-水平 DHE染色半定量分析發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組主動(dòng)脈O2·-水平明顯升高(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，白楊素組家兔主動(dòng)脈O2·-水平顯著降低(P<0.05)，見圖3。

2.4白楊素顯著抑制AS家兔主動(dòng)脈氧化應(yīng)激 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組家兔主動(dòng)脈MDA濃度顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，白楊素組家兔主動(dòng)脈MDA濃度顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)，見圖4。

3 討論

AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種風(fēng)險(xiǎn)因素和遞質(zhì)，循環(huán)膽固醇水平異常至今仍被認(rèn)為是AS重要的病理誘因之一，尤其是LDL和HDL[4]。目前認(rèn)為，升高的血清TG和LDL及降低的HDL具有顯著的促AS作用[5]。在促AS飲食喂養(yǎng)的白化Wistar大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，白楊素能顯著降低AS模型大鼠血清TC、TG和LDL-C，升高HDL-C，并顯著減輕胸主動(dòng)脈中膜層損傷和外膜層厚度[6]。筆者在本研究發(fā)現(xiàn)，白楊素能顯著降低AS家兔血清TC、TG和LDL-C水平，升高HDL-C，減輕AS家兔主動(dòng)脈組織病理學(xué)變化。

圖2 3組家兔主動(dòng)脈組織病理學(xué)變化(×100)

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

氧化應(yīng)激同樣也參與AS發(fā)生發(fā)展。氧化應(yīng)激能夠?qū)е禄钚匝跷镔|(zhì)(reactive oxygen species，ROS)異常增多和抗氧化系統(tǒng)失衡。增多的ROS能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，平滑肌細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞募集及炎癥因子釋放等一系列脂質(zhì)斑塊形成的病理事件[7]。O2·-是ROS主要組成物質(zhì)之一，其降解主要由SOD先催化為過氧化氫，隨后通過谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和過氧化氫酶(catalase，CAT)分解為二氧化碳和水[8]。MDA主要由ROS降解多不飽和脂肪酸產(chǎn)生，其能造成細(xì)胞線粒體DNA損傷并加速AS發(fā)展[9]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白楊素能顯著抑制還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶誘導(dǎo)血管環(huán)O2·-水平[10]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白楊素能顯著提升高膽固醇血癥Wistar大鼠血清和肝臟SOD活性，降低肝臟MDA水平[6，11]。本文發(fā)現(xiàn)，白楊素能顯著降低AS家兔主動(dòng)脈O2·-和MDA水平，升高主動(dòng)脈SOD活性，抑制血管局部氧化應(yīng)激。

本研究也存在部分不足之處：①初步闡明了白楊素可通過抑制血管氧化應(yīng)激起到抗AS作用，白楊素通過何種機(jī)制發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激作用尚需進(jìn)一步研究；②基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的“3R”原則，本研究中未設(shè)置陽性對(duì)照組，在下一步闡明白楊素抗AS作用機(jī)制的研究中，將設(shè)置陽性對(duì)照組進(jìn)一步研究探討。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白楊素能顯著改善AS家兔血清脂質(zhì)異常，減輕主動(dòng)脈組織病理學(xué)變化，降低主動(dòng)脈O2·-水平，抑制主動(dòng)脈氧化應(yīng)激。上述發(fā)現(xiàn)表明，白楊素對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的AS具有顯著的干預(yù)作用，調(diào)節(jié)血脂和抑制主動(dòng)脈氧化應(yīng)激可能是其抗AS作用機(jī)制之一。