潘懿 李軍華

（1，廣西百色市畜禽品種改良技術(shù)推廣站 533000；2，廣西田林縣舊州鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站 533308）

自我國發(fā)生非洲豬瘟疫情來,生豬產(chǎn)能下滑,如何提高能繁母豬產(chǎn)能問題尤為突出,而要保持能繁母豬產(chǎn)能需要數(shù)量充足優(yōu)質(zhì)的豬精液作為后援。當(dāng)前全國優(yōu)質(zhì)豬精液數(shù)量有限且分布不均,提高優(yōu)質(zhì)豬精液利用率顯得十分重要,延長精液保存時(shí)間是提高優(yōu)質(zhì)豬高效精液利用率的前提。為此,筆者在基礎(chǔ)液中添加不同濃度的C3H8O3、VE及6%C3H8O3+VE組合配制成冷凍保存液,探索在超低溫環(huán)境下保存精液最佳的配方,提高豬精液利用率,推動(dòng)生豬產(chǎn)能平穩(wěn)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 保存液及冷凍液的配制

1.1.1 A 液配方

采用《豬精液質(zhì)量評定規(guī)范》的BTS 配方。B 液配方：D-葡糖11.15g,其他與A 液相同。

1.1.2 C3H8O3冷凍保存液配制

在A 液分別加入C3H8O3,調(diào)至最終濃度（V/V）分別為：0%、2%、4%、6%、8%冷凍保存液。

1.1.3 VE冷凍保存液配制

在A 液分別加入分別添加VE,調(diào)至最終濃度為0、0.25、0.50、0.75、1.0mg/ml 冷凍保存液。

1.1.4 6%C3H8O3+不同濃度VE冷凍保存液配制

在B 液加入C3H8O3（V/V）6%,再添加VE,調(diào)至最終濃度為0、0.25、0.50、0.75、1.0mg/ml VE的冷凍保存液。

1.2 精液采集和處理

1.2.1 豬精采集

采自3 歲種公豬,臨床檢疫健康。精液物理性狀正常。精子活率60%以上。

1.2.2 精液處理

洗滌去漿：將精液室溫靜置30s,按1：5 加入基礎(chǔ)液A 常溫200rpm 離心5min,除去上清液得到高濃度的精液,進(jìn)入冷凍預(yù)處理環(huán)節(jié)。

1.3 試驗(yàn)方法及檢測步驟

1.3.1 冷凍液配制

用B 液配制6%C3H8O3+VE冷凍保存液冷凍保存效果試驗(yàn)。先配制6%C3H8O3,再添加VE,調(diào)至5 個(gè)濃度冷凍保存液,分別混入精液,調(diào)整精子最終濃度致1.0 億/ml,再進(jìn)行冷凍前預(yù)處理環(huán)節(jié)。

1.3.2 冷凍前預(yù)處理

將配制好的精液保存液放置15℃平衡60min,搖勻用0.25ml 的聚乙烯細(xì)管分裝封口置4℃的冰箱120min。

1.3.3 精液冷凍

將精管快速浸入距液氮面下7.5cm (-20℃) 平衡30s,再迅速下降至距液氮面下10cm (-80℃) 平衡1min[1],最后于液氮中下部保存,30d 后解凍進(jìn)行檢測。

1.3.4 精液解凍

將精管取出在空中輕搖2s,放入37℃水浴輕搖30s[2],取出擦干剪封口在37℃恒溫檢查,并做好記錄。

1.3.5 解凍后精子質(zhì)量測定

利用RCZ-200G 型精子自動(dòng)分析儀設(shè)定被檢精子總數(shù)200個(gè)為基數(shù)自動(dòng)檢測精子活率、活力、畸形率,評估各組冷凍液冷凍保存效果。

1.3.6 精子頂體檢測

快速改良巴氏染色,相差顯微鏡1000×下隨機(jī)觀察200 個(gè)精子,計(jì)算頂體完整率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤” 表示,用SPSS 進(jìn)行方差分析[3]。

2 結(jié)果

各組冷凍保存液在超低溫(液氮) 中保存精液質(zhì)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果,見表1～3。

3 結(jié)論與討論

3.1 添加濃度（V/V）為6%C3H8O3 保存液對豬精液質(zhì)量保護(hù)效果最明顯

由以上結(jié)果可知,C3H8O3濃度（V/V）為6%、8%保存液解凍后精子的活力、活率、畸形率及頂體完整率與0%C3H8O3（對照組）差異顯著(＜0.05)）,添加濃度為6%C3H8O3整體保護(hù)水平優(yōu)于8%,但差異不顯(＞0.05)。表2 添加濃度0.25mg/ml VE 凍保存精液質(zhì)量效果好。添加量為0.25mg/ml VE精子的活力、活率均高于其他組,但組間差異性不顯著(＞0.05),與對照組差異顯著(＜0.05)；0.5mg/ml VE組精子畸形率最低,與對照組、1mg/ml VE組差異顯著(＜0.05)；0.5mg/ml VE組對精子頂體保護(hù)最佳,與對照組差異極顯著(＜0.01),各試驗(yàn)組間畸形率、頂體完整率差異不顯著(＞0.05)。表3 表明,6%C3H8O3+0.25mg/ml VE組保存精液質(zhì)量效果最好。從試驗(yàn)結(jié)果得出,6%C3H8O3+0.25mg/ml VE組對精子保存的活率、活力均優(yōu)于其他試驗(yàn)組,但試驗(yàn)組間差異不顯著（＞0.05）。

表1 A 液+C3H8O3 保存精液質(zhì)量統(tǒng)計(jì)表

表2 A 液+VE 保存精液質(zhì)量統(tǒng)計(jì)表

表3 B 液+6%C3H8O3+VE 組合保存精液質(zhì)量統(tǒng)計(jì)表

3.2 6%C3H8O3+0.25mg/ml VE 保存效果最好，是超低溫冷凍保存首選配方

將3 個(gè)結(jié)果比對可知,6%C3H8O3+0.25mg/ml VE組各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于其他試驗(yàn)組,除與表2 的0.25mg/ml VE組的精子活率差異顯著 (＜0.05),與其他試驗(yàn)項(xiàng)目差異不顯著 （＞0.05）。C3H8O3和VE混合使用保存效果比單獨(dú)使用效果好,但效果未呈現(xiàn)疊現(xiàn)象。表3 與表2 添加VE同濃度保存效果進(jìn)行比對,表3 冷凍保存效果優(yōu)于表2,但保存效果未出現(xiàn)疊加。

3.3 精液冷凍過程采用分步降溫平衡，減少精子的損傷

冷凍速度可直接影響冷凍保存效果,冷凍速度過快則可能出現(xiàn)水分留滯在精子內(nèi),降溫時(shí)結(jié)成結(jié)冰晶對細(xì)胞造成物理或化學(xué)損傷,過慢則可能細(xì)胞過度脫水,也會導(dǎo)致物理損傷。本試驗(yàn)冷凍過程遵守單向降溫原則,3 步法控制冷凍速度,盡量減少影響精液冷凍保存效果。據(jù)張渭斌等指出,冷凍精液高危險(xiǎn)溫區(qū)為0～60℃[4]。有研究指出,冰晶形成的損傷取決于冰晶大小、數(shù)量和位置[5],精液冷凍保存過程應(yīng)選擇合適的降溫速度。

3.4 加大探索精液低溫冷凍保存技術(shù)解凍過程中損傷精子機(jī)理及解決技術(shù)方案

目前的研究多數(shù)圍繞精液冷凍保存過程對精子造成的物理、化學(xué)及氧化損傷,對解凍帶來的損傷機(jī)理及解決方案研究相對少,建議加大這方面的研究。據(jù)梁鴻斌等研究發(fā)現(xiàn),精子解凍過程要經(jīng)歷兩次臨界溫度區(qū)（-60℃和-15℃）,不同解凍方法對精液品質(zhì)的影響大[6]。選擇適當(dāng)?shù)慕鈨鰷囟燃敖鈨鏊俣?使玻璃化快速越過結(jié)晶態(tài)而直接變?yōu)橐簯B(tài),可減少對精子的傷害[7]。

3.5 適當(dāng)濃度的C3H8O3 可增強(qiáng)精子的抗凍能力

目前,可選擇的抗凍保存劑種類和品種較多,常見滲透性防凍劑有DMSO、C2H6O2及C3H8O3。本次試驗(yàn)選擇使用C3H8O3原因有：首先C3H8O3分子與水分子有親和力,可通過氫和離子鍵與細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細(xì)胞成分構(gòu)型,其次C3H8O3毒性較小,最后C3H8O3容易獲得且物美價(jià)廉。本次試驗(yàn)結(jié)果表明,C3H8O3超低溫保存豬精液保存效果最佳使用濃度為6%（V/V）。劉曉寧等認(rèn)為,C3H8O3對不同物種的精子最佳保存濃度不盡相同[8]。另外,有研究發(fā)現(xiàn),精液低溫冷凍保存添加劑添加最佳濃度具有多個(gè)濃度[9]。

3.6 VE 生物活性能提高精液超低溫冷凍保存質(zhì)量

VE具有活躍的生物活性。首先VE極易發(fā)生氧化,特別喜好與超氧陰離子() 和羥基自由基(OH-）發(fā)生反應(yīng)；其次對某些酶的活性具有保存功能。特別對細(xì)胞膜、線粒體或網(wǎng)狀組織等的磷脂有特殊的親和性,可使精子含磷脂組織或結(jié)構(gòu)免受ROS 攻擊,減少精子膜發(fā)生氧化反應(yīng)概率,同時(shí)保存巰基不易被氧化間接保存多種酶的活性,從而提高精子在超低溫狀態(tài)下延長壽命。本次試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果表明,在超低溫保存液中添加VE可提高精液抗凍水平,添加量為0.25mg/ml 時(shí)綜合保護(hù)水平最佳。

3.7 C3H8O3 與VE 混合添加，增強(qiáng)了精液保護(hù)質(zhì)量

本次試驗(yàn)得出6%C3H8O3+0.25mg/ml VE組各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于其他試驗(yàn)組,隨C3H8O3、VE添加濃度的提高,保護(hù)水平呈先升后降的趨勢。出現(xiàn)這現(xiàn)象原因可能是隨C3H8O3、VE添加濃度（量）的升高,保存液滲透壓隨之升高,峰值后冷凍保存液滲透壓高于精液子能承受最高滲透壓造成的精子損傷。因此,在以后的研究中仍需加強(qiáng)研究各種畜禽精子承受液體滲透壓極限數(shù)據(jù),優(yōu)化冷凍保存液配方,提高超低溫冷凍精液的質(zhì)量。