張善飛 王振華 梁景樂(lè)

（山東勝利生物工程有限公司 272000）

那西肽是活躍鏈霉菌（Streptomyces actuosus）產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,與硫鏈絲菌素(Thiostrepton)、鹽屋霉素(Siomycin)及硫肽霉素(Thiopeptin) 等抗生素結(jié)構(gòu)相似,均屬于含硫多肽類抗生素[1]。紫外線（UV）是一種最常用的物理誘變因素。紫外線輻射能引起DNA 鏈的斷裂、DNA 分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)等,但最主要的是使雙鏈之間或同一條鏈上兩個(gè)相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體,阻礙正常配對(duì),從而引起突變[2]。富集培養(yǎng)亦稱增殖培養(yǎng)、加富培養(yǎng),是指利用不同微生物間生命活動(dòng)特點(diǎn)的不同,人為地提供一些特定的環(huán)境條件,使其按照預(yù)定的方向生長(zhǎng)[3]。通過(guò)前人的研究發(fā)現(xiàn),那西肽的骨架是由各種氨基酸構(gòu)成的,并且現(xiàn)在也基本摸清了那西肽的合成途徑[4],因此,通過(guò)氨基酸富集來(lái)提高那西肽的生產(chǎn)水平很有必要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

那西肽產(chǎn)生菌：活躍鏈霉菌Streptomyces actuosus SL2020012,保存于勝利生物菌種中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

基本斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g,硝酸鉀1g,磷酸氫二鉀0.5g,硫酸鎂0.5g,氯化鈉0.5g,硫酸亞鐵0.01g,瓊脂20g,pH7.5,加水至1000ml,分裝完畢后121℃,滅菌20min,平鋪待用。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30g,玉米漿20g,氯化鈉1g,硫酸銨5g,pH7.0,定容1L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉50g,葡萄糖20g,黃豆粉10g,硫酸銨5g,輕質(zhì)碳酸鈣3g,pH7.2,定容1L。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備

用生理鹽水30ml 加入斜面試管,輕輕刮下孢子,移入裝有20ml0.05%Tween80 溶液和玻璃珠（15 個(gè)）的150ml 三角瓶中,振蕩15min 后,用過(guò)濾裝置（無(wú)菌濾紙+漏斗+50ml 三角瓶）收集濾液。

1.2.2 紫外誘變

提前30min 打開(kāi)紫外燈,將5ml 孢子懸液置于滅過(guò)菌的4.5ml 的培養(yǎng)皿中,放置在磁力攪拌器上,開(kāi)啟磁力攪拌器,打開(kāi)皿蓋,邊照射邊攪拌,并計(jì)時(shí),照射時(shí)間分別為0、30、60、90、120s,計(jì)算致死率。

1.2.3 氨基酸富集培養(yǎng)

將紫外誘變處理后的單孢子溶液涂布于各種0.1%氨基酸（色氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸）的斜面培養(yǎng)基上,28℃,培養(yǎng)168h,篩選高產(chǎn)變株。

1.2.4 高產(chǎn)菌株驗(yàn)證

將篩選好的高產(chǎn)菌株,斜面培養(yǎng)成熟后,接種子瓶,轉(zhuǎn)發(fā)酵瓶,28℃培養(yǎng)168h,測(cè)定那西肽含量,那西肽含量利用HPLC 進(jìn)行檢測(cè)[5]。

2 結(jié)果

2.1 紫外線照射時(shí)間對(duì)出發(fā)菌株致死率的影響

由表1 可知,活躍鏈霉菌經(jīng)過(guò)紫外線照射,致死率隨著UV 照射時(shí)間的增加而提高。在0～110s 的UV 照射下,菌株的致死率為0%～100%。其中UV 誘變處理90s 時(shí),平板上的存活的單菌落為61 個(gè),與對(duì)照組（115 個(gè)菌落）相比,90s 時(shí)的致死率與以往前人所得的結(jié)論致死率在70%～85%的一致,所以該菌株最適的處理時(shí)間為90s。

表1 UV 照射時(shí)間對(duì)出發(fā)菌株致死率的影響

2.2 氨基酸富集培養(yǎng)后單菌情況

將誘變處理的孢子液涂布于含有氨基酸的平板,情況如表2。由表2 可知,3 種氨基酸對(duì)活躍鏈霉素的數(shù)量基本沒(méi)有太大影響,但對(duì)單菌大小影響較大。半胱氨酸單菌大小較對(duì)照提高10%。

表2 UV 誘變的氨基酸富集培養(yǎng)情況

2.3 高產(chǎn)菌株驗(yàn)證情況

表3 高產(chǎn)菌株驗(yàn)證情況

由表3 可知,對(duì)于效價(jià)半胱氨酸效果最好,提高24%。色氨酸提高10%,而蘇氨酸卻降低6%。

3 討論

本試驗(yàn)利用紫外誘變和氨基酸富集培養(yǎng)能有效篩選出那西肽高產(chǎn)菌株。主要原因可能為那西肽的結(jié)構(gòu)是由氨基酸組成,另外,合成途徑中半胱氨酸是轉(zhuǎn)化為噻唑環(huán)的前體,而噻唑環(huán)是那西肽的重要組成部分。綜上,紫外誘變富集培養(yǎng)是獲得那西肽高產(chǎn)菌株的有效方法。