（吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062）

2019新型冠狀病毒?。╟oronavirus disease 2019，COVID-19）是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2，SARS-CoV-2）引起的一種主要通過近距離空氣、飛沫傳播和密切接觸傳播的呼吸道傳染病[1]，目前在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，并已造成世界范圍的大流行。截至北京時間2020年5月15日2時31分，全球累計確診人數(shù)已達4 386 761人，累計死亡人數(shù)已達297 043人[2]，并且仍在增加。該病毒屬于基因組最大的一類RNA病毒，容易發(fā)生變異，這給疾病的診斷、預(yù)防和治療都帶來了較大困難。

人感染SARS-CoV-2后的常見體征有發(fā)燒、乏力，部分出現(xiàn)干咳，少數(shù)有流鼻涕、鼻塞以及胃腸道癥狀[3]，嚴重的可導(dǎo)致肺炎、嚴重急性呼吸綜合征、腎衰竭，甚至死亡[1]。報道[1，4]顯示：該病毒在人群中傳染性明顯增加，致死率為2%～4%，雖然比普通流感高，但遠比嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）、埃博拉病毒和H7N9流感病毒低；該病的中位潛伏期只有3 d，長的可達24 d以上，且在家庭和社區(qū)有明顯的聚集發(fā)病現(xiàn)象。

與SARS-CoV相同，SARS-CoV-2含有單股正鏈RNA基因組，具有5'帽子（cap）和3' poly（A）尾巴的結(jié)構(gòu)，長度在29.5～30.3 kb之間[5-6]。基因組由11個開放閱讀框（open reading frame，ORF）組成，分別編碼ORF1ab，刺突蛋白（spike protein，S），ORF3a，囊膜蛋白（envelope，E），膜蛋白（membrane protein，M），ORF6，ORF7a，ORF7b，ORF8，核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）和ORF10[6-8]。序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2與SARS-CoV的核酸序列約有80%的相似性[9]，而與蝙蝠源冠狀病毒RaTG13（GenBank號 MN996532）的全基因組同源性達93.7%～96.2%，其ORF1ab、N和S蛋白的氨基酸同源性分別為98.5%、99.05%和97.41%[10]。

研究表明，冠狀病毒的刺突蛋白（S），囊膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣殼蛋白（N）對病毒感染有重要作用。它們的主要功能是入侵宿主細胞，維持病毒粒子形態(tài)，幫助病毒粒子裝配、釋放，其中S、M、E 3種蛋白位于病毒囊膜表面[11]，而N蛋白則位于病毒囊膜內(nèi)側(cè)。

以往的SARS-CoV研究發(fā)現(xiàn)：在感染過程中，S蛋白與宿主表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin I converting enzyme 2，ACE2）結(jié)合[12]，并經(jīng)過網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白非依賴型內(nèi)吞途徑進入細胞[13]，然后將病毒基因組釋放到宿主細胞質(zhì)中。而在病毒組裝過程中，M蛋白的C端和核衣殼相互作用形成一個核心結(jié)構(gòu)，S蛋白則與病毒囊膜合為一體，然后再與M、E蛋白相互作用，從而完成病毒粒子裝配，然后成熟的病毒粒子穿膜釋放到胞外[14-15]。因此，M和E蛋白可能與S蛋白在病毒包膜形成過程中起共同作用[15-17]。也有研究[17-21]推測，E蛋白與病毒傳染性有關(guān)。

目前研究[22]顯示，SARS-CoV-2的S蛋白結(jié)構(gòu)與SRAS-CoV非常相似，同樣可與ACE2結(jié)合，并且靶向SARS-CoV S蛋白的中和抗體也可與SARS-CoV-2相結(jié)合[22]。因此，S蛋白受體結(jié)合域也是相關(guān)抗體、疫苗研發(fā)的重要靶點。

N蛋白最重要的功能是識別病毒基因組RNA的特征序列，與病毒基因組RNA結(jié)合形成螺旋狀的核衣殼，并與其他結(jié)構(gòu)蛋白相互作用，完成病毒粒子裝配[9，11，15]。此外，N蛋白也可能與病毒RNA合成[23]以及病毒建立感染有關(guān)[24-25]。

眾所周知，蛋白質(zhì)的功能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。本研究借助生物信息學(xué)蛋白分析工具，分析SARSCoV-2的4個結(jié)構(gòu)蛋白的分子生物學(xué)特征，并預(yù)測4種蛋白的部分結(jié)構(gòu)域，以期為更好地了解該病毒，并為SARS-CoV-2的相關(guān)分子生物學(xué)研究和針對其結(jié)構(gòu)蛋白的疫苗開發(fā)等提供參考，也為后期的COVID-19防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

選取NCBI上公布的SARS-CoV-2的4種結(jié)構(gòu)蛋白序列進行特性分析，其中S蛋白為YP_009724390，M蛋白為YP_009724393，E蛋白為YP_009724392，N蛋白為YP_009724397。

1.1 氨基酸組成分析

應(yīng)用DNAstar軟件的子程序Protean，分析蛋白的氨基酸組成。

1.2 信號肽預(yù)測

應(yīng)用SignalP-5.0[26]在線服務(wù)器（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/），預(yù)測4種蛋白各自的信號肽及其剪切位點。

1.3 亞細胞定位預(yù)測

用在線服務(wù)器PSORT Prediction（http://psort1.hgc.jp/form.html），對4種蛋白進行亞細胞定位。

1.4 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

使 用TMHHM 2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0），預(yù)測4種蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。

1.5 BUSCA綜合分析

使用BUSCA在線服務(wù)器（http://busca.biocomp.unibo.it/），綜合分析、預(yù)測4種蛋白的信號肽、跨膜區(qū)和亞細胞定位。

1.6 B細胞抗原表位預(yù)測

應(yīng)用ABCpred[27]在線服務(wù)器（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html），直接預(yù)測S蛋白的B細胞抗原表位；應(yīng)用DNAstar軟件的子程序Protean，采用Kyte-Doolittle[28]方法，預(yù)測4種蛋白的親水性；用Karplus-Schultz[29]方法，預(yù)測4種蛋白的可變性；用Emini[30]方法，預(yù)測4種蛋白的表面可及性；用Jameson-Wolf[31]方法，預(yù)測抗原指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸組成分析

應(yīng)用DNAstar軟件的子程序Protean，對蛋白的氨基酸組成進行分析發(fā)現(xiàn)，E蛋白的核酸序列含有228 nt（nucleotide），編碼75個氨基酸。該蛋白相對分子質(zhì)量為8 365.06 Da，等電點為8.33。在構(gòu)成E蛋白的氨基酸中，亮氨酸（Leu）占比最高，達到18.67%；而天冬氨酸（Asp）、谷氨酰胺（Gln）、甲硫氨酸（Met）和色氨酸（Trp）占比最低，僅為1.33%。此外，E蛋白不含組氨酸、色氨酸和谷氨酰胺。

M蛋白的核酸序列含有669 nt，編碼222個氨基酸。該蛋白相對分子質(zhì)量為25 146.68 Da，等電點為9.48。在構(gòu)成M蛋白的氨基酸中，Leu占比最高，達到 15.77%；而半胱氨酸（Cys）、Met和Gln占比最低，僅為1.8%。

S蛋白的核酸序列為3 822 nt，編碼1 273個氨基酸。該蛋白相對分子質(zhì)量為141 178.84 Da，等電點為6.47。在構(gòu)成S蛋白的氨基酸中，Leu占比最高，達到8.48%；而Trp占比最低，僅為0.94%。

N蛋白的核酸序列有1 260 nt，編碼419個氨基酸。N蛋白相對分子質(zhì)量為45 625.69 Da，等電點為10.10。在構(gòu)成N蛋白的氨基酸中，甘氨酸（Gly）占比最高，達到8.48%；而組氨酸（His）占比最低，僅為0.95%。此外，N蛋白不含Cys。

2.2 信號肽預(yù)測

經(jīng)SignalP 5.0預(yù)測，N、M和E 3種蛋白N端存在信號肽的可能性極小。而S蛋白在N端存在信號肽，且有96.89%的可能性屬于常規(guī)分泌（Sec/secretory）通路，由I型信號肽酶（SPase I，SPI）進行切除。信號肽剪切位點有53.53%的可能性在15～16 aa（SQC-VN）處（圖1）。

2.3 亞細胞定位

用PSORT Prediction預(yù)測，發(fā)現(xiàn)N蛋白存在于細胞核內(nèi)的可能性最大（表1），而S蛋白最可能存在于質(zhì)膜，可能性為46.0%，其次是微體（表2）。

E、M蛋白最可能定位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，但M蛋白也有46.0%的可能性存在于高爾基體（表3～4）。

圖1 S蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果

表1 N蛋白亞細胞定位預(yù)測結(jié)果

表2 S蛋白亞細胞定位預(yù)測結(jié)果

表3 E蛋白亞細胞定位預(yù)測結(jié)果

表4 M蛋白亞細胞定位預(yù)測結(jié)果

2.4 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用TMHHM 2.0預(yù)測4種蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：E蛋白1～11 aa在膜內(nèi)，35～75 aa在膜外，12～34 aa為跨膜區(qū)（圖2-A）；M蛋白40～50、101～222 aa在膜內(nèi)，1～19、74～77 aa在膜外，20～39、51～73、78～100 aa為跨膜區(qū)（圖2-B）；S蛋白1～1 213 aa在膜外，1 237～1 273 aa在膜內(nèi)，1 214～1 236 aa為跨膜區(qū)（圖2-C）；N蛋白則全部處于膜外，無跨膜區(qū)（圖2-D）。

圖2 S、E、M、N蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

2.5 BUSCA預(yù)測

使用BUSCA在線服務(wù)器，對4種蛋白進行綜合分析預(yù)測，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與前面的預(yù)測基本相符，表明E、M、S蛋白均定位于質(zhì)膜上，N蛋白定位于胞質(zhì)內(nèi)，但E、M蛋白也有可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。E蛋白9～42 aa為α螺旋跨膜區(qū)，M蛋白14～36、42～68、75～101 aa為α螺旋跨膜區(qū)，S蛋白1～21 aa為信號肽區(qū)段，1 051～1 062、1 213～1 234 aa為α螺旋跨膜區(qū)。

2.6 B細胞抗原表位預(yù)測

根據(jù)之前的分析，E、M蛋白多為α螺旋跨膜，N蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，因此選擇S蛋白預(yù)測其抗原表位。由于抗原決定簇區(qū)域通常具有較好的親水性、表面可及性和柔性，因此本研究使用DNAstar子程序Protean，對S蛋白的親水性、柔性、表面可及性和抗原指數(shù)進行分析，選擇這4種方法預(yù)測結(jié)果中共有的區(qū)段作為潛在的B細胞抗原表位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S蛋白的抗原位點較可能在20～29、75～81、95～98、111～116、148～152、181～186、458～466、575～581、676～685、773～779、809～815、1071～1 076、1 141～1 145、1 147～1 156、1 158～1 165、1182～1 187、1 204～1 208、1 258～1 262 aa處（圖3）。

圖3 Protean預(yù)測S蛋白抗原表位結(jié)果

而ABCpred則給出較多抗原表位預(yù)測結(jié)果，且表位主要集中在S蛋白序列的中間區(qū)域。將Protean和ABCpred預(yù)測的結(jié)果進行對比，篩選出共有抗原表位在25～29、75～81、112～116、148～152、773～779 aa。

3 討論

關(guān)于SRAS-CoV-2的生物學(xué)和流行病學(xué)等特性仍存在許多未知。目前，對SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)蛋白的研究也大多集中在S蛋白的受體結(jié)合域（RBD）[32]、抗原表位[33-34]和疫苗設(shè)計[32]等方面，而對E、M、N蛋白結(jié)構(gòu)的研究卻較少，因此本研究對S、E、M、N蛋白的結(jié)構(gòu)域進行多種分析。而鑒于它們的二級結(jié)構(gòu)特征，本研究使用不同的方法[27，29-31，35]預(yù)測S蛋白B細胞抗原位點，并給出共有抗原表位。

表5 ABCpred預(yù)測S蛋白抗原表位得分高于0.85的結(jié)果

本研究對不同的結(jié)構(gòu)域預(yù)測使用了不同的方法。BUSCA得到的復(fù)合結(jié)果與之前使用SignalP、PSORT prediction和TMHHM得到的結(jié)果基本一致，均提示S蛋白N端存在信號肽，S、E、M蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)域，N蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域。這與報道的冠狀病毒4種結(jié)構(gòu)蛋白各自的分布及功能相符[9，11-12，24，36]。而在抗原表位預(yù)測中，基于S蛋白序列特征，預(yù)測出抗原表位25～29、75～81、112～116、148～152、773～779 aa更可能是潛在的抗體靶標。這一結(jié)果與之前報道的潛在抗原表位有所一致[34]。

本研究通過對SARS-CoV-2的4種結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)特征進行分析，進一步了解了4種蛋白的結(jié)構(gòu)域特征，也為下一步的分子生物學(xué)和實驗動物學(xué)研究提示了方向。在后期工作中，將在目前研究基礎(chǔ)上，分析該病毒結(jié)構(gòu)蛋白特征，并尋找可能的藥物靶點，合成抗體肽，進行更多分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)學(xué)科的交叉研究，希望能為解析該病毒的感染和致病機制以及為相關(guān)藥物設(shè)計、臨床治療提供參考。同時本研究采用的思路和方法對于研究其他病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，以及針對其蛋白設(shè)計相應(yīng)的抗體、藥物等也會有一定的參考價值。