（中國海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心，北京 100026）

水泡性口炎（vesicular stomatitis，VS）是由水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）引起的多種哺乳動物和人感染的一種人獸共患傳染病，其中馬、牛、豬和某些野生動物較易感，綿羊和山羊也可感染，但不發(fā)生自然感染，臨床上以口、鼻等黏膜和皮膚水泡及糜爛為特征。該病可以跨界、跨物種傳播，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為須通報動物疫病，在我國為外來動物疫病，是我國動物和動物產(chǎn)品國際貿(mào)易中的重要檢疫對象[1-5]。VSV有2個血清型，代表株分別為新澤西株（VSV-NJ）和印第安納株（VSV-IND）。易感動物對不同血清型感受性不同，馬、牛、豬是VSV-NJ型病毒的主要自然宿主，而VSV-IND曾引起牛和馬的水泡性口炎流行，但不引起豬的疾病。這兩個血清型在血清學(xué)和免疫學(xué)上獨立，但臨床癥狀難以區(qū)分[4-8]。本研究建立了可以同步檢測和鑒別VSV-NJ和VSVIND的雙重?zé)晒釸T-PCR方法，以期為VS的防控提供技術(shù)儲備。

1 材料與方法

1.1 試驗質(zhì)控品

VSV-NJ和VSV-IND陽性質(zhì)控品，均為本實驗室制備的L基因體外轉(zhuǎn)錄cRNA（VSV-NJ-LcRNA和VSV-IND-L-cRNA）；測試所用的其他病毒，均為本實驗室制備的核酸質(zhì)控品，上述核酸質(zhì)控品均按常規(guī)方法制備[9-10]。

1.2 主要試劑及儀器

pGEM-T載 體、Riboprobe RNA Production System-T7體外轉(zhuǎn)錄試劑，為Promega公司產(chǎn)品；Ex-TaqPCR試劑，為TaKaRa公司產(chǎn)品；Path-IDTMMultiplex one-step RT-PCR kit，為AB公司產(chǎn)品；TIANamp Virus DNA/RNA Kit，為天根公司產(chǎn)品；CFX-96熒光PCR儀，為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 引物和探針設(shè)計與合成

下載GenBank中現(xiàn)有VSV-NJ和VSV-IND所有分離株基因，使用CLCMain Workbench 7.0.3和BioEditor 1.6.1分析軟件進行多重比較，選取L基因作為擴增靶基因，根據(jù)雙重?zé)晒釸T-PCR特點分別設(shè)計并篩選出能覆蓋大部分分離株、又適合雙重檢測，并可以區(qū)分不同血清型的引物和探針（序列見表1）。引物和探針由TaKaRa（大連寶生物）合成，用滅菌水稀釋成100 mmol/L儲藏液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 陽性質(zhì)控品濃度測定

VSV-NJ-L-cRNA和VSV-IND-L-cRNA陽性質(zhì)控品經(jīng)測序確認后測定其OD260和OD280值，按照公式[6.02×1023×濃度（ng/μL）×10-9]/[片段長度（bp）×660]計算拷貝數(shù)，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 雙重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)

將引物和探針儲備液按照引物終濃度400 nmol/L和探針終濃度200 nmol/L分別進行10倍稀釋和混合，引物混合液包括VSV-NJ引物3條和VSV-IND引物2條，探針混合液包括VSVNJ、VSV-IND探針各1條（表1）。按照表2配制反應(yīng)體系。

將混合液充分混合，最后加入模板，簡短離心，按照下列程序進行一步法雙重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)：48 ℃ 10 min、95 ℃ 10 min進行反轉(zhuǎn)錄，95 ℃ 15 s變性、60 ℃ 45 s退火，44個循環(huán)擴增。

表1 新澤西型和印第安納型水泡性口炎病毒一步法雙重?zé)晒釸T-PCR檢測引物和探針

表2 一步法雙重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)體系

1.6 標準曲線繪制和最低檢測限確定

分別將已知濃度的VSV-NJ和VSV-IND陽性質(zhì)控品按照10-1～10-11進行10倍梯度稀釋后進行熒光RT-PCR反應(yīng)，用模板濃度-熒光Ct值做單熒光RT-PCR濃度標準曲線，最高稀釋倍數(shù)能檢測出的Ct值所對應(yīng)的濃度即為單熒光RT-PCR最低檢測限。

再將已知濃度的VSV-NJ和VSV-IND陽性質(zhì)控品等量混合，按照10-1～10-11進行10倍梯度稀釋后進行雙重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)，用模板濃度-熒光Ct值做雙重?zé)晒釸T-PCR濃度標準曲線，最高稀釋倍數(shù)能檢測出的Ct值所對應(yīng)的濃度即為雙重?zé)晒釸T-PCR最低檢測限。

1.7 特異性測試

選擇實驗室保存?zhèn)溆玫呢i流感病毒（SIV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬水泡病病毒（SVDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬瘟病毒（CSFV）、牛病毒性腹瀉黏膜病毒（BVDV）、牛地方流行性白血病病毒（EBLV）、口蹄疫病毒（FMDV）、藍舌病病毒（BTV）等9種病毒質(zhì)控品，分別用VSV-NJ和VSV-IND的引物和探針進行單熒光RT-PCR，驗證引物和探針的特異性。

用建立的雙重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)體系同時對上述9種病毒質(zhì)控品進行檢測，驗證引物和探針混合后雙重反應(yīng)體系的特異性。

1.8 雙重?zé)晒釸T-PCR和單熒光RT-PCR比較

將VSV-NJ和VSV-IND陽性質(zhì)控品等量混合后進行10倍梯度稀釋，分別進行雙重?zé)晒釸TPCR和單熒光RT-PCR，將相同濃度模板對應(yīng)的熒光Ct值進行比較，求解回歸方程，比較雙重?zé)晒釸T-PCR和各單熒光RT-PCR的符合性。

1.9 方法驗證

用建立的雙重?zé)晒釸T-PCR對細胞培養(yǎng)病毒核酸進行驗證，對50份臨床樣品進行測試，并與單熒光RT-PCR進行比較。

2 結(jié)果

2.1 陽性質(zhì)控品定量

將保存?zhèn)溆玫年栃再|(zhì)控品，分別用紫外分光儀測定其260 nm和280 nm的吸光度值并計算出濃度和拷貝數(shù)（表3）。

2.2 標準曲線和最低檢測限

分別用VSV-NJ和VSV-IND陽性質(zhì)控品做濃度標準曲線。如圖1所示，標準曲線PCR擴增效率E值、R2和曲線斜率均在正常范圍內(nèi)，說明擴增效率良好。將模板進行10-11稀釋仍能檢測到熒光信號，根據(jù)表3濃度，計算出對應(yīng)的最低檢測限在10 copies/μL左右。

VSV-NJ和VSV-IND混合質(zhì)控品雙重?zé)晒釸T-PCR標準曲線見圖2。從圖2可知，雙重?zé)晒釸T-PCR擴增效率E值分別為99.5%和99.0%，R2值分別為0.999和0.998，曲線斜率均在正常范圍內(nèi)，說明擴增效率并沒有受到雙重干擾。相同稀釋倍數(shù)對應(yīng)的Ct值比單熒光RT-PCR略有升高，但不構(gòu)成顯著差異，最低檢測限仍然可達10 copies/μL。

2.3 特異性檢測

單個病毒的引物和探針只能擴增出各自的病毒核酸，其他病毒模板的擴增均為陰性，表明所設(shè)計的引物和探針特異性良好。利用建立的雙重?zé)晒釸T-PCR方法對VSV-NJ和VSV-IND及1.7中所列病毒進行檢測，結(jié)果僅VSV-NJ和VSVIND有擴增曲線，其他病毒均無特異性擴增信號（表4），表明所建立的方法特異性良好，雙重并沒有對特異性產(chǎn)生干擾。

表3 陽性質(zhì)控品純度及含量測定

圖1 VSV-NJ（A）與VSV-IND（B）的熒光RT-PCR標準曲線

圖2 VSV-NJ和VSV-IND雙重?zé)晒釸T-PCR標準曲線

2.4 雙重?zé)晒釸T-PCR和單熒光RT-PCR比較

利用相同濃度的混合模板同時進行雙重?zé)晒釸T-PCR和單熒光RT-PCR的符合性測試，回歸方程計算結(jié)果顯示，VSV-NJ和VSV-IND單熒光RTPCR與雙重?zé)晒釸T-PCR的相關(guān)性系數(shù)R2分別為0.9997和0.9994，說明雙重?zé)晒釸T-PCR和各單熒光RT-PCR的符合性良好，對于相同濃度的模板，其Ct值基本一致，所有引物和探針放在一個反應(yīng)體系混合后并沒有相互干擾（圖3）。

圖3 VSV-NJ（A）和VSV-IND（B）單熒光RT-PCR與雙重?zé)晒釸T-PCR的比較

表4 特異性檢測結(jié)果

2.5 驗證

利用本研究建立的雙重?zé)晒釸T-PCR對本實驗室保存的2份VSV-NJ和2份VSV-IND細胞培養(yǎng)病毒核酸進行檢測，結(jié)果均為陽性；對50份臨床樣品的篩查結(jié)果均為陰性，與單熒光RT-PCR檢測結(jié)果一致。

3 討論

VS是人獸共患傳染病，多種動物易感，常見于馬、騾、牛、豬和野生動物，羊一般不發(fā)生自然感染，不同動物感染臨床癥狀相似。VSV的2個血清型VSV-NJ和VSV-IND對易感動物的感受性不同，其中馬、牛、豬是VSV-NJ的主要自然宿主，而馬和牛經(jīng)常感染VSV-IND，但豬一般不感染VSV-IND[1-2]。VSV的診斷主要靠血清學(xué)和分子生物學(xué)方法，ELISA方法是使用最廣泛的血清學(xué)試驗，但不能區(qū)分VSV的兩個血清型，而這兩個血清學(xué)感染后癥狀相同，臨床上難以區(qū)分[1-2]。因此，本研究借助不同血清型的特異性基因序列，設(shè)計了針對兩個血清型的特異性引物和探針，建立了可以同步檢測和鑒別VSV-NJ和VSV-IND的雙重?zé)晒釸T-PCR方法。

該方法與Hole、Femandez等[4-6]人的研究方法相比，最低檢測限可達10 copies/μL，達到了目前熒光PCR技術(shù)的較好敏感性指標[7，11-12]；特異性為100%，不管是單模板，還是混合模板，引物和探針均只能擴增出各自的目標病原，其他相關(guān)病毒測試均未見非特異性擴增；結(jié)果表明，建立的雙重?zé)晒釸T-PCR與單熒光RT-PCR檢測結(jié)果一致，可快速、同步檢測VSV-NJ和VSV-IND，從而為VS的防控工作提供了技術(shù)儲備。