（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109）

鸚鵡喙羽病是由喙羽病病毒（psittacine beak and feather disease virus，PBFDV）引起的一種常見的鸚鵡傳染病，患病鸚鵡羽毛、喙部變形，胸腺及法氏囊結(jié)構(gòu)異常，通常造成幼雛死亡[1]，可垂直傳播；按病程長短可分為急性型、慢性型和亞臨床型，急性型常發(fā)生于幼雛，患病鸚鵡突然死亡[2]，慢性型和亞臨床型常發(fā)生于成年鸚鵡，導(dǎo)致羽毛、喙和爪子畸形[3]。喙羽病于20世紀70年代在澳大利亞首次被發(fā)現(xiàn)，之后隨著活禽貿(mào)易而蔓延至全球[4]。PBFDV屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus）成員，為單鏈環(huán)形DNA病毒[5]，基因組大小為2 000 bp，編碼復(fù)制相關(guān)蛋白（replication-associated protein，Rep）和衣殼蛋白（capsid protein，Cap）2 個主要蛋白[2，5]。電鏡觀察病毒呈14～16 nm無包膜二十面體[6]。鸚鵡幼雛?。╞udgerigar fledgling disease，BFD）是由禽多瘤病毒（avian polyomavirus，APV）引起的急性傳染病，是目前對鸚鵡危害最為嚴重的傳染病之一[7]，3周齡以下的鸚鵡雛鳥易感，表現(xiàn)為羽毛發(fā)育遲緩、消瘦、腹部腫脹和神經(jīng)癥狀等，致死率極高。BFD于1980年初首先在美國被發(fā)現(xiàn)，隨后在澳大利亞、日本、意大利、匈牙利、斯洛伐克和德國等被陸續(xù)報道，現(xiàn)已蔓延至世界各地[8]。我國于1994年首次在湖北省發(fā)現(xiàn)該病，并確認該病由APV引起[9]。APV為乳多空病毒科（Polyomaviridae）多瘤病毒屬（Polyomavirus）成員，為無囊膜、環(huán)形雙鏈 DNA[10]，基因組大小為4 981 bp，編碼Large T、Small t、VP1、VP2、VP3、VP4 和 VP4 Delta 等7種蛋白[11]。

鸚鵡作為一種觀賞鳥類，越來越受人們的喜愛，因而鸚鵡養(yǎng)殖業(yè)隨之興起。隨著鸚鵡養(yǎng)殖業(yè)的擴大和進口量的增加，疾病也越來越多。PBFDV和APV是感染鸚鵡的常見病毒，嚴重危害鸚鵡的健康，對鸚鵡養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大影響，導(dǎo)致嚴重經(jīng)濟損失。2019年12月山東省青島市某虎皮鸚鵡養(yǎng)殖場2～3周齡幼鳥出現(xiàn)腹瀉、脫水、腹部腫大，嗉囊飽滿，排白綠色糞便，糞便糊肛，發(fā)育遲緩等臨床癥狀，大量鸚鵡幼雛死亡，死亡率達到80%。成鳥無死亡，無明顯發(fā)病癥狀，產(chǎn)蛋正常。該場鸚鵡未接種過任何疫苗，發(fā)病后曾用恩諾沙星、土霉素、雙黃連等藥物進行治療。本研究對該養(yǎng)殖場的患病幼鳥進行了臨床診斷，使用PCR方法進行了相關(guān)病毒檢測，無菌采集發(fā)病幼鳥組織進行細菌分離鑒定等細菌學(xué)檢測，確診為PBFDV、APV及鏈球菌混合感染，并提出相應(yīng)的治療措施。

1 材料與方法

1.1 病理剖檢及病料采集

對送檢的死亡和發(fā)病的10～15日齡的虎皮鸚鵡幼鳥進行病理剖檢觀察，無菌采集發(fā)病鸚鵡的肝臟、肺臟及心包積液進行病原檢測。

1.2 實驗室檢測及藥敏試驗

1.2.1 主要試劑 TSA、TSB培養(yǎng)基及革蘭氏染色液，均購自青島海博生物有限公司；MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒，購于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司（TaKaRa）；一步法PCR試劑盒（Dye Plus），購自諾唯贊生物科技有限公司；禽腺病毒及鸚鵡熱衣原體熒光定量PCR試劑盒，購自青島巴特菲生物科技有限公司；細菌核酸提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2.2 PCR檢測 根據(jù)參考文獻合成PBFDV、APV、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）引物，由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成（表1）。無菌采集適量發(fā)病鸚鵡的肝、肺組織研磨后取上清，使用病毒核酸提取試劑盒提取上清液中的病毒核酸（DNA/RNA）采用普通PCR方法檢測PBFDV、APV、NDV及AIV用熒光定量試劑盒檢測禽腺病毒和衣原體。

表1 PCR檢測引物

1.2.3 細菌分離鑒定 無菌采集鸚鵡肝臟及心包積液，劃線接種于TSA培養(yǎng)基及血瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h。挑取單個純菌落，進行革蘭氏染色鏡檢。取分離得到的單個菌落接種到肉湯試管中培養(yǎng)增菌，過夜培養(yǎng)菌液，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA，利用通用引物[15]擴增細菌16S rDNA，PCR產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序，所得序列進行BLAST比對分析。

1.2.4 藥敏試驗 操作程序參考李桂喜等[16]試驗方法。采用紙片瓊脂擴散法對分離得到的菌株進行阿莫西林克拉維酸、強力霉素、頭孢他啶、頭孢曲松、妥布霉素、大觀霉素、慶大霉素、多粘菌素B、林可霉素、左氧沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、磺胺甲惡唑等藥物的藥敏試驗，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，根據(jù)美國NCCLS藥敏試驗標準判定藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理剖檢

剖檢發(fā)現(xiàn)：肝臟表面有大小不等的黃白色壞死灶，呈大理石樣外觀（圖1-A）；心包積液，心肌出血；腹腔積液呈黃色，有膠凍樣滲出（圖1-B）；十二指腸出血（圖1-C），肌胃出血；肺出血，氣管環(huán)出血（圖1-D），輸尿管有白色尿酸鹽沉積，脾臟腫大。

圖1 病理剖檢結(jié)果

2.2 實驗室檢測

2.2.1 PCR檢測 對提取的核酸進行PCR、RTPCR以及熒光定量PCR擴增，結(jié)果NDV、AIV、禽腺病毒、衣原體均為陰性。PBFDV、APV的PCR擴增目的條帶與預(yù)期大小一致，分別為495 bp、318 bp，PBFDV在肝組織檢測為陽性，肺組織為陰性；APV在肝、肺組織均檢測為陽性（圖2）。

圖2 PCR檢測結(jié)果

2.2.2 細菌分離鑒定 TSA培養(yǎng)基上出現(xiàn)半透明、圓形、表面光滑、整齊的菌落（圖3-A），血瓊脂平板上出現(xiàn)不同程度的溶血（圖3-B），革蘭氏染色陽性，呈單個或雙鏈排列，有些呈短鏈狀排列（圖3-C）。對提取的細菌核酸進行PCR擴增，得到長度為1 428 bp的目的條帶（圖4），與預(yù)期片段大小相符。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對分析確定該分離菌株為鏈球菌。

圖3 細菌分離鑒定結(jié)果

圖4 16sDNA PCR檢測結(jié)果

2.2.3 藥敏試驗 藥敏試驗結(jié)果（表2）顯示，該分離菌對阿莫西林克拉維酸高度敏感，強力霉素中度敏感，而對頭孢他啶、頭孢曲松、妥布霉素、大觀霉素、慶大霉素、多粘菌素B、林可霉素、左氧沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、磺胺甲惡唑不敏感。

表2 藥敏試驗結(jié)果

3 防治

PBFDV和BFD目前尚無有效的治療藥物和疫苗。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果對鏈球菌進行抗菌治療，建議該場鸚鵡使用阿莫西林克拉維酸飲水5 d。同時建議鸚鵡養(yǎng)殖場的主人做好，嚴格消毒；保持鳥舍良好的環(huán)境衛(wèi)生和豐富的營養(yǎng)飼料，飼料或飲水中加入適量的維生素、微量元素等營養(yǎng)成分，以提高免疫力。及時淘汰病鳥，防止疾病的傳播和蔓延。場長反饋用藥5 d后死亡率有所下降。

4 討論

PBFD和BFD是鸚鵡的常見傳染病，在鸚鵡養(yǎng)殖中較為多發(fā)，危害嚴重，對幼雛影響較大，致死率較高，成年鸚鵡無明顯的臨床癥狀，這為養(yǎng)殖場的疾病預(yù)防工作造成了極大影響。本研究針對青島市某鸚鵡養(yǎng)殖場的發(fā)病情況進行了相關(guān)病毒PCR檢測，結(jié)果顯示PBFDV和APV呈陽性，排除了流感病毒、新城疫病毒、腺病毒以及衣原體的感染，并分離鑒定出鏈球菌，確診該病例為PBFDV、APV及鏈球菌混合感染。PBFDV和APV感染鸚鵡的研究早已被多次報道，曾有研究者證明，1994年BFD在我國已經(jīng)開始傳播，并證明病原為APV[9]。APV引起B(yǎng)FD的病例被發(fā)現(xiàn)的時間較早，但始終沒有引起人們重視。PBFD于20世紀70年代在澳大利亞首次被發(fā)現(xiàn)，之后隨著活禽貿(mào)易而蔓延至全球[4]。蔣文明等[12]在2009年首次報道了PBFDV在我國大陸地區(qū)鸚鵡種群的傳播，后PBFDV也陸續(xù)在我國養(yǎng)殖場中檢出，但始終沒有引起人們的重視。Fogell等[17]在8個沒有報道過PBFDV的國家中檢測出PBFDV，表明該病毒的分布比目前所掌握的更廣泛。有研究發(fā)現(xiàn)，活禽貿(mào)易是PBFDV傳播的重要方式[18]。因此，需要加強鸚鵡疾病的檢測與防控工作，以及進口鸚鵡的防疫檢測，建立合理有效的鸚鵡病檢疫程序，以保證鸚鵡養(yǎng)殖業(yè)的平穩(wěn)發(fā)展。PBFDV和APV混合感染的情況比較多見，而且PBFD和BFD癥狀相似，在診斷時要做到準確診斷，做好鑒別區(qū)分，如1998年Ramis等[19]首次在鸚鵡養(yǎng)殖舍中發(fā)現(xiàn)PBFDV和APV的混合感染，吳汝娟等[20]對青島市的發(fā)病鸚鵡進行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)存在PBFDV和APV的雙重感染。在疾病過程中常常繼發(fā)細菌感染，因此對致病菌的檢測必不可少。本研究在患病鸚鵡的肝臟組織中分離鑒定出鏈球菌。鏈球菌為條件性致病菌，通常在一定誘因的作用下才會發(fā)病。本研究推斷，該養(yǎng)殖場發(fā)病的原因可能是由于冬季溫度降低，舍內(nèi)通風不良，導(dǎo)致PBFD、BFD及鏈球菌的混合感染。藥敏試驗結(jié)果顯示，該菌對阿莫西林克拉維酸高度敏感，而對頭孢他啶等多種藥物均耐藥，所以臨床使用抗生素一定要選用敏感藥物，切忌亂用藥，以免造成更大的損失。

近年來，我國引進大量鸚鵡，造成外來鸚鵡疾病的傳播，但對于鸚鵡疾病的研究卻很少。由于對疾病的認識不足以及不夠重視，導(dǎo)致許多疾病的防疫工作難以進行，治療也無計可施。希望本研究能引起廣大鸚鵡養(yǎng)殖戶的重視，也為PBFD和PFD的防治提供一定的參考。