（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224）

藍(lán)舌病（bluetongue，BT）是由藍(lán)舌病病毒（bluetongue virus，BTV）引起的，通過(guò)媒介昆蟲(chóng)庫(kù)蠓傳播的蟲(chóng)媒病毒病[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報(bào)動(dòng)物疫病，我國(guó)將其歸為一類動(dòng)物疫病。該病主要發(fā)生在熱帶、亞熱帶地區(qū)，近年來(lái)有北移趨勢(shì)，主要引起綿羊、牛等反芻動(dòng)物發(fā)病，尚無(wú)有效的治療方法[2]。目前全球已報(bào)道27種BTV血清型，我國(guó)分離到BTV-1、2、3、4、5、7、9、12、14、15、16、21、24等13種血清型[3-10]。不同血清型毒株在同一區(qū)域同時(shí)流行時(shí)，容易發(fā)生基因重組，且不同血清型之間缺乏有效的交叉免疫保護(hù)，這給BT防控帶來(lái)了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[11-12]。

云南省地處我國(guó)西南邊陲，有5個(gè)州市25個(gè)縣（市）與緬甸、老撾和越南交界，有11個(gè)國(guó)家級(jí)口岸、9個(gè)省級(jí)口岸及數(shù)百條邊境通道，邊境線長(zhǎng)4 060 km，是我國(guó)通往東南亞、南亞的關(guān)口。近年來(lái)，由于國(guó)內(nèi)肉類價(jià)格持續(xù)增高，每年有大量牛等活動(dòng)物通過(guò)邊境線進(jìn)入我國(guó)境內(nèi)，使云南省邊境地區(qū)BT防控形勢(shì)更為嚴(yán)峻。為掌握云南省邊境地區(qū)BT流行情況，本研究采用BTV C-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒和微量血清中和試驗(yàn)方法，對(duì)2019年云南省邊境5個(gè)州市12個(gè)縣（市）送檢的1 580份牛血清樣品進(jìn)行了BTV檢測(cè)和血清分型，以期為我國(guó)BT防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

牛血清樣品來(lái)自云南省邊境地區(qū)5個(gè)州市12個(gè)邊境縣（市），其中德宏州（芒市、瑞麗市）365份，西雙版納州（景洪市、勐?？h、勐臘縣）649份，文山州（富寧縣）31份，普洱市（孟連縣、西盟縣、江城縣）255份，臨滄市（滄源縣、鎮(zhèn)康縣、耿馬縣）280份，均由所在縣（市）的動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心送檢。

1.2 主要儀器和試劑

Multiskan FC酶標(biāo)儀，購(gòu)自Thermo公司；脫脂奶粉，購(gòu)自BD difco公司；BTV C-ELISA檢測(cè)試劑盒、PBSTM（磷酸鹽緩沖液+Tween 20+脫脂奶粉），為云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備；BTV 24個(gè)型的參考病毒，由本實(shí)驗(yàn)室保存；Corning Incorporated 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、PBS干粉、Tween 20，均購(gòu)自云南豐科生物科技有限公司。

1.3 血清抗體檢測(cè)

按照BTV C-ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)待檢血清進(jìn)行檢測(cè)，讀取OD450值，計(jì)算血清樣品抑制率，判定血清是否為陽(yáng)性[13]。試劑盒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔OD450≤0.2，兩孔間OD450差值＜0.05，兩個(gè)陰性對(duì)照孔1.0≤OD450＜1.6，兩孔間OD450差值＜0.2。判定標(biāo)準(zhǔn)：按照抑制率（PI）=（陰性對(duì)照OD450平均值-樣品血清OD450值）/陰性對(duì)照OD450平均值×100%；抑制率≥50%，判為抗體陽(yáng)性，否則為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 血清型鑒定

從C-ELISA檢出的BTV陽(yáng)性血清樣品中，每縣（市）隨機(jī)挑選15～55份進(jìn)行微量血清中和試驗(yàn)；按Karber方法計(jì)算24個(gè)血清型標(biāo)準(zhǔn)毒株的半數(shù)感染量（TCID50）；參照GB/T18636—2017[14]中的方法，將24個(gè)BTV標(biāo)準(zhǔn)毒株與BTV抗體陽(yáng)性血清進(jìn)行中和試驗(yàn)，確定BTV血清型。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體檢測(cè)

2.1.1 地區(qū)分布 從各縣（市）送檢的1 580份牛血清樣品中，均檢測(cè)到BTV抗體陽(yáng)性血清（表1），共檢出陽(yáng)性血清1 155份，抗體陽(yáng)性率為73.1%，表明牛BTV感染在云南省邊境地區(qū)普遍存在。各縣（市）BTV抗體陽(yáng)性率有所差異，其中芒市最高（94.1%），滄源縣最低（17.0%）。各州市BTV總陽(yáng)性率比較結(jié)果顯示：臨滄市最低（43.6%），與其他州市差異均顯著（P＜0.05）；西雙版納州與德宏州比較，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.1.2 群間分布 本地牛和入境牛BTV血清抗體統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）顯示：本地牛和入境牛血清BTV抗體陽(yáng)性率差異不大（P＞0.05），分別為74.1%和72.9%。

表1 云南邊境地區(qū)牛BTV血清抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表2 本地牛和入境牛BTV血清抗體統(tǒng)計(jì)

2.2 血清型鑒定

2.2.1 BTV血清型分布 對(duì)隨機(jī)選取的541份BTV抗體陽(yáng)性血清樣品進(jìn)行血清微量中和試驗(yàn)檢測(cè)。結(jié)果（表3）顯示：共鑒定出17種血清型，數(shù)量在100份以上的依次是BTV-1、16、3、5、21、15。各縣（市）均存在5個(gè)以上血清型分布，其中：景洪市最多，有14個(gè)，滄源縣最少，有5個(gè)，其他縣（市）在6～11個(gè)之間。各州（市）優(yōu)勢(shì)血清型并不相同，德宏州2個(gè)市均存在BTV-3、5、15、16、17、18、21、24型8個(gè)血清型；西雙版納州1市2縣均存在BTV-1、13、16、21、24型5個(gè)血清型感染，普洱市3縣均存在BTV-4型，臨滄市3縣均存在BTV-3、5、21型3個(gè)血清型。

表3 各縣（市）牛BTV陽(yáng)性血清中和抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 BTV血清型混合統(tǒng)計(jì) 對(duì)各縣（市）存在的16個(gè)BTV血清型進(jìn)行混合感染統(tǒng)計(jì)的結(jié)果（表4）顯示：在541份血清型定型樣品中，存在77種兩種血清型混合感染，其中BTV-3型與BTV-5型混合感染樣品數(shù)量最多，有18份，占定型樣品總數(shù)的3.3%；其次是BTV-16型與BTV-21型混合感染，有15份，占定型樣品總數(shù)的2.8%，BTV-3型與BTV-16型、BTV-5型與BTV-16型混合感染均有14份，占定型樣品總數(shù)的2.6%。

3 討論

蟲(chóng)媒病毒病防制極為困難，全球每年因BTV感染而導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)30億美元[15]。我國(guó)對(duì)BT等動(dòng)物蟲(chóng)媒病的研究相對(duì)滯后。1979年張念祖等[15]首次在云南省師宗縣發(fā)現(xiàn)BTV，此后湖北（1983）、安徽（1985）、四川（1988）等省份分別報(bào)道發(fā)現(xiàn)BTV。2017年血清學(xué)和病原學(xué)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)11個(gè)省份63個(gè)市區(qū)檢測(cè)到BTV抗體陽(yáng)性[16-20]。BTV可能會(huì)因庫(kù)蠓移動(dòng)傳播、新血清型傳入和致病性增強(qiáng)等引起牛群大規(guī)模發(fā)病，影響牛產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展及相關(guān)畜產(chǎn)品貿(mào)易[21]，因此加強(qiáng)BTV血清學(xué)調(diào)查對(duì)該病的預(yù)防與控制極為重要。

本次檢測(cè)在云南省邊境地區(qū)5個(gè)州市12個(gè)縣（市）的送檢牛血清樣品中均檢測(cè)到BTV抗體，表明BTV在云南邊境地區(qū)流行廣泛。本研究的云南省12個(gè)邊境縣（市）均位于熱帶或者亞熱帶地區(qū)，與越南、老撾、緬甸接壤，年均氣溫較高、日照時(shí)間較長(zhǎng)、降雨量較多，適于各類庫(kù)蠓生長(zhǎng)和繁殖，有利于BTV傳播。由于本次檢測(cè)樣品數(shù)量有限，且均為送檢樣品，檢出結(jié)果可能不能真實(shí)反映該地流行情況，但對(duì)于了解BTV在該地的流行狀況和特點(diǎn)具有參考意義。來(lái)源地為本地和境外的牛血清樣品間抗體陽(yáng)性率差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明云南邊境地區(qū)BTV流行態(tài)勢(shì)與緬甸、老撾、越南類似，這可能與云南邊境地區(qū)氣候環(huán)境、傳播媒介等與上述三個(gè)國(guó)家類似有關(guān)。

表4 各縣（市）牛BTV血清型交叉感染情況統(tǒng)計(jì)

本研究應(yīng)用微量血清中和試驗(yàn)，進(jìn)行BTV血清型鑒定，發(fā)現(xiàn)各市縣均存在5個(gè)以上的血清型分布，這可能與不同血清型BTV毒株在同一區(qū)域或宿主機(jī)體感染時(shí)易發(fā)生基因重組的特性有關(guān)。此外，在各州（市）流行的優(yōu)勢(shì)血清型也不同，這可能與地理位置和傳播媒介庫(kù)蠓的種類差異有關(guān)[22]。

4 結(jié)論

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BT在我國(guó)云南邊境地區(qū)流行廣泛，且流行血清型復(fù)雜，多種血清型混合感染較嚴(yán)重，需要持續(xù)開(kāi)展血清學(xué)調(diào)查。