王 剛，仲婷婷，蔣 毅，陳璽龍，王小琴，王慧云

慢性腦缺血(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)是指由各種病因誘發(fā)的腦血流長期灌注不足，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病病程中起關(guān)鍵作用[1]。慢性腦缺血的早期臨床表現(xiàn)主要為記憶下降及逐漸進展的認知和運動障礙，病理損傷機制及神經(jīng)保護機制復雜，目前尚未完全明確，嚴重影響病人及家屬的日常工作及生活[2]。據(jù)統(tǒng)計，慢性腦缺血發(fā)病率在我國呈現(xiàn)逐年增高趨勢，其原因與現(xiàn)代人群飲食方式改變及老齡化進程加劇有關(guān)[3]。因此，對慢性腦缺血發(fā)病機制及治療方案的研究，已成為臨床亟待解決的問題。臨床對慢性腦缺血發(fā)病機制的研究主要集中在神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂、氧化應激、細胞凋亡、突觸異常、炎癥損傷、能量代謝障礙等方面[4]；對其神經(jīng)功能保護方面，研究主要集中在是神經(jīng)再生、神經(jīng)再生障礙、神經(jīng)營養(yǎng)因子和抑制性因子等方面，雖已取得了可喜的成果，但仍存在部分不足[4]。有研究表明，長春西汀有明顯的“益智作用”，并對腦缺血后神經(jīng)功能具有一定的保護作用[5]。本研究觀察長春西汀對慢性腦缺血大鼠的神經(jīng)保護機制，為臨床治療慢性腦缺血提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康成年Wistar 大鼠30只，雄性，鼠齡 3～4 個月，體重(270±30)g，動物領(lǐng)取后置于潔凈飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)1周開始進行實驗，飼養(yǎng)濕度 70%，溫度(22±3) ℃，自由飲水，晝夜正常交替。

1.2 試劑與儀器 長春西汀注射液[商品名：潤坦，河南潤弘制藥股份有限公司生產(chǎn)，國藥準字H20041792，規(guī)格：每支2 mL(20 mg)]；Nogo-A一抗、OMgp一抗及MAG一抗均購自北京博奧森生物工程有限公司；兔抗大鼠白細胞介素-1β(interleukin-1 β，IL-1β)抗體、兔抗大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 抗體、兔抗小鼠白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)抗體均購自美國Abcam 公司；LEICA ASP200S自動脫水機(德國)；LEICA EG1150H 組織包埋機(德國)；LEICA圖像采集分析系統(tǒng)(德國)。

1.3 分組及造模 30只Wistar 大鼠依據(jù)隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組及長春西汀組，每組10只，模型組及長春西汀組使用雙側(cè)頸總動脈永久性阻斷法(bilateral common carotid artery permanent occlusion，2VO)[6]制作大鼠慢性腦缺血模型。方法：大鼠術(shù)前12 h禁食、禁水，腹腔注射7%水合氯醛麻醉，頸正中切開后，鈍性分離游離雙側(cè)頸總動脈，分別結(jié)扎其遠心端、近心端，從中間剪斷，以確保頸總動脈無血流通過，縫合切口，術(shù)后各組大鼠均在常規(guī)條件下飼養(yǎng)。假手術(shù)組以相同方法行頸前皮膚切開，分離、暴露但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，逐層縫合切口。長春西汀組于2VO術(shù)后 24 h內(nèi)給予長春西汀10 mg/kg腹腔內(nèi)注射，假手術(shù)組、模型組給予等量生理鹽水注射，共注射21 d。

1.4 觀察指標 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定各組大鼠腦組織勻漿中IL-1β、IL-10、TNF-α含量；使用免疫組化法檢測大鼠海馬區(qū)組織中勿動蛋白 (Nogo-A)、少突膠質(zhì)細胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte-myelin glycoprotein，OMgp)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein，MAG)表達情況；采用免疫組化法結(jié)合圖像分析，檢測各組大鼠海馬CA1區(qū)腦源性神經(jīng)生長因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠腦組織勻漿中 IL-1β、IL-10、TNF-α含量比較 模型組及長春西汀組腦組織勻漿中 IL-1β、TNF-α含量均高于假手術(shù)組(P<0.05)，IL-10含量則均低于假手術(shù)組(P<0.05)；長春西汀組大鼠腦組織勻漿中 IL-1β、TNF-α含量低于模型組(P<0.05)，IL-10含量則高于模型組(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組大鼠腦組織中IL-1β、IL-10、TNF-α含量比較(±s) 單位：ng/mL

2.2 各組大鼠海馬組織中 Nogo-A、OMgp、MAG表達比較 假手術(shù)組及長春西汀組大鼠海馬組織中 Nogo-A、OMgp、MAG表達均低于模型組(P<0.05)；長春西汀組大鼠海馬組織中 Nogo-A、OMgp、MAG表達高于假手術(shù)組(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠海馬組織中 Nogo-A、OMgp、MAG表達比較(±s)

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF表達比較 假手術(shù)組及長春西汀組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF表達均高于模型組(P<0.05)；長春西汀組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF表達低于假手術(shù)組(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF表達比較(±s)

3討 論

慢性腦缺血是臨床常見病，多發(fā)于中老年人群，主要臨床癥狀可表現(xiàn)為頭暈、視物不清、頭重等，嚴重時可造成病人神經(jīng)功能損傷，對病人正常工作及身心健康影響極大[7]。慢性腦缺血病理過程復雜，是因慢性腦灌注下降導致腦功能障礙的臨床綜合征，相對于急性或亞急性腦缺血，其具有可干預時間窗較長的特點，如能早期診斷并積極治療，可有效阻斷疾病進展，降低腦血管相關(guān)事件發(fā)生的風險[8-9]。有研究表明，在腦灌流不足所誘發(fā)的系列級聯(lián)反應過程中，免疫炎癥反應可貫穿腦損傷的全過程[10-11]。而在多梗死灶型血管性癡呆及阿爾茨海默病病人外周血中，炎性因子含量均異常，表明炎性因子參與腦灌注不足所誘發(fā)的系列級聯(lián)反應過程[12]。另有實驗證實，腦缺血時內(nèi)皮細胞炎癥反應使被激活的巨噬細胞、少突膠質(zhì)細胞等釋放大量的IL-1β、TNF-α，從而激活促炎反應[10，13]。IL-1β、TNF-α在腦缺血損傷中的作用已有很多相關(guān)報道，而IL-10在腦缺血損傷中的作用報道相對較少。本研究對大鼠腦組織勻漿中IL-1β、IL-10、TNF-α含量進行檢測后發(fā)現(xiàn)，模型組及長春西汀組腦組織勻漿中 IL-1β、TNF-α含量均高于假手術(shù)組(P<0.05)，IL-10含量則均低于假手術(shù)組(P<0.05)；長春西汀組大鼠腦組織勻漿中 IL-1β、TNF-α 含量低于模型組(P<0.05)，IL-10含量則高于模型組(P<0.05)。表明長春西汀可抑制慢性腦缺血大鼠炎癥反應，有利于減輕缺血、缺氧對神經(jīng)元的損害。中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的再生能力，但軸突再生抑制因子可阻礙神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的神經(jīng)功能恢復，而Nogo-A、OMgp及MAG 是機體主要的神經(jīng)生長抑制因子，在慢性腦缺血時Nogo-A、OMgp及MAG表達明顯增強[14-15]。大腦海馬區(qū)CA1區(qū)神經(jīng)保護因子對腦區(qū)神經(jīng)元缺血損傷較為敏感，而BDNF通過與其受體TrkB的結(jié)合，啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16-17]。VEGF則通過與其受體 VEGFR2結(jié)合，發(fā)揮促進微血管生成及血管內(nèi)皮細胞增殖作用，使受損病變區(qū)域血供恢復，進而修復受損神經(jīng)元[18-19]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織中 Nogo-A、OMgp、MAG陽性表達最高，長春西汀組次之，假手術(shù)組則最低；假手術(shù)組及長春西汀組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF表達均高于模型組(P<0.05)；長春西汀組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF表達低于假手術(shù)組(P<0.05)。證實長春西汀對慢性腦缺血大鼠神經(jīng)保護作用機制可能是通過抑制Nogo-A、OMgp及MAG過度表達，促進大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF表達來實現(xiàn)的。

綜上所述，長春西汀通過抑制慢性腦缺血大鼠炎性反應及大腦海馬區(qū) Nogo-A、OMgp 、MAG 的表達，促進大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及VEGF表達，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。