王 月,盧 叢,劉天生,陳韶萍,尤民生,*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所,閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350002; 2.福建農(nóng)林大學(xué),教育部害蟲生態(tài)防控國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,福州 350002;3.福建農(nóng)林大學(xué), 農(nóng)業(yè)部閩臺作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350002)

內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(endogenous retroviruses,ERVs)被認(rèn)為是生物進(jìn)化過程中外源逆轉(zhuǎn)錄病毒在宿主基因組中的殘余序列，能夠整合進(jìn)宿主生殖系統(tǒng)，所以在宿主基因組中世代存留(L?weretal.,1996)。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組兩端有與外源逆轉(zhuǎn)錄病毒類似的長末端重復(fù)序列(long terminal repeat sequence,LTRs)，中間有1～3個(gè)主要的開放閱讀框(gag,pol和env)編碼病毒復(fù)制所需的結(jié)構(gòu)和功能蛋白：gag編碼衣殼蛋白；pol編碼蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H和整合酶；env編碼產(chǎn)物用于細(xì)胞受體的識別和病毒的侵入(Misserietal.,2004)。通常認(rèn)為，昆蟲內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的侵染能力跟env基因的表達(dá)相關(guān)(Teyssetetal.,1998)。

在多種脊椎動物和非脊椎動物基因組中都發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，比如鼠、牛、果蠅等(Terzianetal.,2001;Garcia-Etxebarria and Jugo,2010,2016)，人類基因組中此類序列約占8%(Belshawetal.,2004)，家蠶基因組中也報(bào)道了256條內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒序列(Fengetal.,2018)。由于結(jié)構(gòu)相似，內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒一度被認(rèn)為是LTR轉(zhuǎn)座子，后繼發(fā)現(xiàn)果蠅中g(shù)ypsy和ZAM元件具有侵染活性(Kimetal.,1994;Leblancetal.,2000)，此類序列元件被劃定為內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒。但是國際病毒分類學(xué)委員會把脊椎動物內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒歸于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)，卻把昆蟲內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒歸于轉(zhuǎn)座病毒科(Metaviridae)(Fablet,2014)。經(jīng)典的脊椎動物內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒在宿主正常的生物學(xué)過程及疾病發(fā)生過程中可能有著重要的作用(Wangetal.,2013;Bustamante Riveraetal.,2017)。在昆蟲學(xué)研究領(lǐng)域，黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(gypsy,17-6,297,ZAM,Idefix,nomad,tirant)、黑果蠅Drosophilavirilis(Tv1)、嗜鳳梨果蠅Drosophilaananassae(tom)、粉紋夜蛾Trichoplusiani(Ted)和地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata(yoyo)等物種發(fā)現(xiàn)了多種內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒元件(Terzianetal.,2001)，甚至gypsy和ZAM的活性周期都有了詳細(xì)報(bào)道(Kimetal.,1994;Leblancetal.,2000)，但內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒對宿主的生物學(xué)意義卻一無所知。

小菜蛾P(guān)lutellaxylostella是世界范圍內(nèi)分布非常廣泛的鱗翅目害蟲，已經(jīng)對許多重要的十字花科經(jīng)濟(jì)作物造成毀滅性的破壞(Furlongetal.,2013)。在小菜蛾精巢發(fā)育的全轉(zhuǎn)錄組(數(shù)據(jù)未發(fā)表)研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)env基因，本研究以env基因位點(diǎn)為起始點(diǎn)，用生物信息學(xué)方法鑒定到一個(gè)小菜蛾內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒元件PxERV，并分析了該內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的序列結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步對env基因檢測分析，揭示了該內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制特性，有助于研究內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒對小菜蛾的影響，為探究昆蟲內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒對宿主的生物學(xué)意義奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx及飼養(yǎng)

供試小菜蛾為實(shí)驗(yàn)室人工飼料飼養(yǎng)的G88品系和2009年福州野外采集后在實(shí)驗(yàn)室用蘿卜苗繼代飼養(yǎng)的福州敏感品系(FZ)，飼養(yǎng)條件為溫度23～25℃，光周期為16L∶8D。

1.2 小菜蛾P(guān)xERV的鑒定及序列結(jié)構(gòu)分析

在小菜蛾精巢全轉(zhuǎn)錄組(數(shù)據(jù)未公布)分析中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)基因(編號為MSTRG.10684)，經(jīng)預(yù)測發(fā)現(xiàn)該基因序列有Baculo_F保守結(jié)構(gòu)域，屬桿狀病毒融合蛋白(Baculovirus F protein)家族，是一類糖蛋白，可能是內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的env基因。在小菜蛾基因組上以PxERV的env基因(編號為MSTRG.10684，克隆序列下載網(wǎng)址http:∥iae.fafu.edu.cn/DBM/family/index.php)位點(diǎn)為起始點(diǎn)，上下游各以10 kb為窗口，用LTR_Finder(Xu and Wang,2007)鑒定LTR結(jié)構(gòu)，確定PxERV的DNA序列；用NCBI工具CD-Search預(yù)測序列所包含的保守結(jié)構(gòu)域；用ORFfinder預(yù)測env基因的開放閱讀框。

1.3 PxERV的env基因克隆

分別取小菜蛾福州敏感品系(FZ)成蟲以及G88品系成蟲(GA)和幼蟲(GL)各10頭，單頭置于1.5 mL離心管中，液氮冷凍后，加鋼珠高速破碎；用DNeasy Bloodand Tissue Kit試劑盒(QIAGEN)按照產(chǎn)品說明書提取小菜蛾基因組DNA；分別用核酸蛋白測定儀和瓊脂糖凝膠電泳對DNA濃度及完整性進(jìn)行檢測；樣品于-20℃保存。用Primer Premier在小菜蛾P(guān)xERV的env基因上下游設(shè)計(jì)克隆引物S51_F/S51_R(表1)，由福州博尚生物技術(shù)有限公司合成，以小菜蛾基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(25 μL):2×Hieff Canace Gold PCR Master Mix 12.5 μL,DNA 1 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序:98℃ 3 min;98℃ 10 s,55℃ 20 s,72℃ 1 min,32個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，將未純化PCR產(chǎn)物送樣，委托福州博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因測序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 env基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

為探究小菜蛾P(guān)xERV的env與其他包膜糖蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，我們從NCBI和果蠅數(shù)據(jù)庫(Thurmondetal.,2019)下載了已知的14種昆蟲內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒env基因編碼的氨基酸序列和9種昆蟲核型多角體病毒(nucleopolyhedrovirus,NPVs)的F或gp64包膜糖蛋白序列，共29條；用MEGA6(Tamuraetal.,2013)的鄰接法(Saitou and Nei,1987)對小菜蛾P(guān)xERV的env預(yù)測氨基酸序列與29條氨基酸序列進(jìn)行了進(jìn)化樹分析。

1.5 qPCR檢測env基因表達(dá)

分別在G88品系小菜蛾4齡幼蟲、蛹期第0天、蛹期第1天、蛹期第2天和成蟲期5個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，其中精巢樣品各取樣時(shí)間點(diǎn)每50頭蟲的精巢為1個(gè)重復(fù)，重復(fù)取樣3次；蟲體樣品各取樣時(shí)間點(diǎn)每20頭剖去精巢的蟲體為1個(gè)重復(fù)，重復(fù)取樣3次。按照 Eastep Super總RNA提取試劑盒(Promega,北京)操作說明提取總RNA。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀檢測其完整性、純度和濃度，然后以1 μg總RNA為模板，按照GoScript Reverse Transcription System試劑盒(Promega,北京)合成cDNA第1鏈，-20℃保存。

以1.3節(jié)克隆得到的env基因序列為參考設(shè)計(jì)qPCR引物10684.q_F/10684.q_R(表1)，以合成的cDNA為模板，以核糖體蛋白(PxL32)基因和延伸因子(PxEF1)基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物序列見表1，每個(gè)樣品有3個(gè)技術(shù)重復(fù)，用GoTaq qPCR Master Mix試劑盒(Promega，北京)在儀器(CFX96 TouchTMReal-time PCR Detection System,C1000 TouchTMThermal Cycler,Bio-Rad,美國)上進(jìn)行PCR，測定env基因的表達(dá)情況。反應(yīng)體系(20 μL):2×Go Taq qPCR Master Mix 10 μL,ddH2O 8 μL,cDNA 1 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL。反應(yīng)程序:95℃ 2 min;95℃ 15 s,60℃ 1 min,40個(gè)循環(huán)。

取兩個(gè)內(nèi)參基因CT值的幾何平均值為內(nèi)參CT值，用2-ΔΔCT法(Livak and Schmittgen,2001)計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.6 qPCR檢測env基因拷貝數(shù)

以1.3節(jié)提取的小菜蛾福州敏感品系(FZ)成蟲以及G88品系成蟲(GA)和幼蟲(GL)基因組DNA為檢測樣本模板，以1.5節(jié)的qPCR方法測定env基因在上述樣本基因組中的拷貝數(shù)。未添加DNA模板的對照的CT值為35，取35與相應(yīng)樣本CT值的差值為該樣本env基因拷貝數(shù)的量化值，進(jìn)行不同樣本間env基因拷貝數(shù)的比較分析。

1.7 CRISPR/Cas9介導(dǎo)env基因突變

以1.3節(jié)克隆得到的小菜蛾P(guān)xERV的env基因序列為參考，在預(yù)測的ORF區(qū)設(shè)計(jì)gRNA引物10684gRNA-F/10684gRNA-R(表1)，用PCR合成gRNA的DNA模板，反應(yīng)體系(50 μL):DNA合成酶25 μL,上下游引物(10 μmol/L)各3 μL,ddH2O 19 μL。反應(yīng)程序:95℃ 3 min;95℃ 15 s,68℃ 15 s,72℃ 20 s,29個(gè)循環(huán);72℃ 2 min。取65 ng上述PCR產(chǎn)物，加2.5 μL NTP Mix和0.5 μL T7 RNA Mix(HiScribeTMT7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit,NEB)，用ddH2O補(bǔ)至5 μL。37℃，12 h合成gRNA。取400 ng的gRNA與250 ng的Cas9蛋白(GenCrispr Cas9-N-NLS Nuclease，金斯瑞)混勻，37℃孵育20 min；用顯微注射儀對260顆G88品系小菜蛾產(chǎn)下30 min內(nèi)的卵進(jìn)行注射。G0代成蟲與野生型交配，F(xiàn)1代開始一雌一雄自交，每代取單頭成蟲提DNA(方法同1.3節(jié))，用檢測引物10684.d-F/10684.d-R(表1)擴(kuò)增檢測片段，送樣委托福州博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.8 數(shù)據(jù)分析

用IBM SPSS Statistics 22采用單因素方差進(jìn)行基因相對表達(dá)量和拷貝數(shù)的差異分析，并進(jìn)行Tukey HSDa顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PxERV的序列結(jié)構(gòu)分析及鑒定

以PxERV的env基因(編號為MSTRG.10684)位點(diǎn)為起始點(diǎn)，上下游各以10 kb為窗口，發(fā)現(xiàn)上游6 250 bp處為5′LTR，下游1 824 bp處為3′LTR，長度約268 bp。進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析(圖1)發(fā)現(xiàn)，env基因上游有由開放閱讀框pol編碼的蛋白酶(retro)、整合酶(rve)、RNA酶H(RNaseH)和逆轉(zhuǎn)錄酶(RT_LTR)4種逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白結(jié)構(gòu)域。綜合分析結(jié)果，該P(yáng)xERV元件全長8 343 bp，有pol和env兩個(gè)開放閱讀框，不包含閱讀框gag，沒有完整的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)，符合昆蟲內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR-pol-env-LTR結(jié)構(gòu)(Misserietal.,2004;Fengetal.,2018)。

圖1 小菜蛾內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒元件PxERV基因組結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Genome structure of Plutella xylostella endogenous retroviral element PxERVretro:蛋白酶 Protease;RNase:RNA酶H Ribonuclease H;rve:整合酶 Integrase;RT_LTR:逆轉(zhuǎn)錄酶Reverse transcriptase;Baculo_F:包膜糖蛋白F Envelope glycoprotein F.

2.2 env基因克隆及分析

克隆得到env基因序列長2 051 bp，預(yù)測最長ORF長約1 617 nt，編碼538個(gè)氨基酸。系統(tǒng)發(fā)育分析(圖2)發(fā)現(xiàn)，昆蟲內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒env基因的蛋白氨基酸序列與昆蟲核型多角體病毒(NPV)的包膜糖蛋白氨基酸序列明顯分為兩支；小菜蛾P(guān)xERV的env基因與果蠅Drosophilabuzzatii的逆轉(zhuǎn)座子osvaldo及粉紋夜蛾Trichoplusiani內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒Ted的env基因進(jìn)化關(guān)系最近。

圖2 基于氨基酸序列構(gòu)建的昆蟲內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒env基因編碼的氨基酸序列與核型多角體病毒包膜糖蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接法,1 000次重復(fù))Fig.2 Phylogenetic tree of amino acid sequences coded by env genes of endogenous retroviruses (ERVs) and envelope glycoproteins of nucleopolyhedroviruses (NPVs) of insects constructed based on the amino acid sequence (neighbor-joining method,1 000 replicates)昆蟲內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒env和核型多角體病毒包膜糖蛋白序列來源物種及其GenBank登錄號 Source species of env proteins of ERVs and envelope glycoproteins of NPVs of insects and their GenBank accession numbers:DmeGypV:黑腹果蠅Drosophila melanogaster,M12927;Dme176V:黑腹果蠅D.melanogaster,X01472;Dme297V:黑腹果蠅D.melanogaster,X03431;DmeZamV:黑腹果蠅D.melanogaster,AJ000387;DmeIdeV:黑腹果蠅D.melanogaster,AJ009736;DanTomV:嗜鳳梨果蠅D.ananassae,Z24451;DsuGypV:果蠅D.subobscura,X72390;DviGypV:黑果蠅D.virilis,M38438;DviTvIV:黑果蠅D.virilis,AF056940;TniTedV:粉紋夜蛾Trichoplusia ni,M32662;CcaYoyV:地中海實(shí)蠅Ceratitis capitata,U60529;Dmespringer:黑腹果蠅D.melanogaster,AF364549;Dmecruiser:黑腹果蠅D.melanogaster,AF364550;Dbuosvaldo:果蠅D.buzzatii,AJ133521;AcMNPVC6_gp64:苜蓿銀紋夜蛾Autographa californica,L22858;AcMNPVC6_F:苜蓿銀紋夜蛾A.californica,L22858;AcMNPVE2_gp64:苜蓿銀紋夜蛾E2核型多角體病毒A.californica,KM667940;AcMNPVE2_F:苜蓿銀紋夜蛾A.californica,KM667940;BmNPV_gp64:家蠶Bombyx mori,KJ186100;BmNPV_F:家蠶B.mori,KJ186100;OpMNPV_gp64:黃杉合毒蛾Orgyia pseudotsugata,U75930;OpMNPV_F:黃杉合毒蛾O.pseudotsugata,U75930;LdMNPV_gp64:舞毒蛾Lymantria dispar,KX618634;LdMNPV_F:舞毒蛾L.dispar,KX618634;SeMNPVx4_F:甜菜夜蛾Spodoptera exigua,HG425345;SeMNPVG25_F:甜菜夜蛾S.exigua,HG425347;HaNPV_F:棉鈴蟲Helicoverpa armigera,NC_003094;PxMNPV_gp64:小菜蛾P(guān)lutella xylostella,DQ457003;PxMNPV_F:小菜蛾P(guān).xylostella,DQ457003;M10684:小菜蛾P(guān).xylostella,MSTRG.10684.

2.3 env基因的表達(dá)

我們對5個(gè)發(fā)育時(shí)期的小菜蛾G88品系蟲體和精巢中env基因的表達(dá)情況進(jìn)行了qPCR檢測，結(jié)果(圖3)顯示該env基因在成蟲精巢中特異性高表達(dá)(P<0.05)，在其他發(fā)育時(shí)期的蟲體和精巢之間表達(dá)量都沒有顯著差異(P>0.05)，但在成蟲時(shí)期的蟲體中比其他時(shí)期蟲體中表達(dá)量稍高；在精巢中的表達(dá)量總體比在蟲體中表達(dá)量稍高。

圖3 env基因在小菜蛾G88品系不同發(fā)育階段蟲體和精巢中的相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of env gene in the body and testis of Plutella xylostella strain G88 at different developmental stagesLB:4齡幼蟲蟲體Body of the 4th instar larva;PB0d:蛹期第0天蟲體Body of the 0-d-old pupa;PB1d:蛹期第1天蟲體Body of the 1-d-old pupa;PB2d:蛹期第2天蟲體Body of the 2-d-old pupa;AB:成蟲期蟲體Adult body;LT:4齡幼蟲精巢Testis of the 4th instar larva;PT0d:蛹期第0天精巢Testis of the 0-d-old pupa;PT1d:蛹期第1天精巢Testis of the 1-d-old pupa;PT2d:蛹期第2天精巢Testis of the 2-d-old pupa;AT:成蟲期精巢Adult testis.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫字母表示基因表達(dá)量在不同發(fā)育時(shí)期的蟲體和精巢間差異顯著(P<0.05,Tukey HSDa檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE.Different lowercase letters above bars indicate significant differences in the gene expression level among insect bodies and testes at different developmental stages (P<0.05,Tukey HSDa test).

2.4 env基因在小菜蛾不同品系中的拷貝數(shù)

qPCR檢測env基因表達(dá)情況時(shí)，G88品系成蟲期精巢的生物學(xué)重復(fù)不太穩(wěn)定，我們猜測可能是由于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒元件的拷貝數(shù)不同引起的。經(jīng)檢測(圖4)，env基因的拷貝數(shù)在小菜蛾不同品系個(gè)體間確實(shí)存在差異。另外，在福州敏感品系(FZ)個(gè)體中env基因的拷貝數(shù)顯著少于G88品系個(gè)體中的拷貝數(shù)(P<0.05)，G88品系的幼蟲期個(gè)體與成蟲期個(gè)體中env基因拷貝數(shù)沒有顯著差異(P>0.05)。

圖4 env基因在小菜蛾不同品系和不同齡期的拷貝數(shù)Fig.4 Copy number of env gene in different stains and developmental stages of Plutella xylostella未添加DNA模板的對照的CT值為35，取35與相應(yīng)樣本CT值的差值(ΔCT值)為該樣本env基因拷貝數(shù)的量化值。The CT value of the control without DNA template was 35,and the difference between 35 and the CT value (ΔCT value) was taken to be the quantized value of the env gene copy number in this sample.FZ:福州敏感品系成蟲Adult of the susceptible strain from Fuzhou;GA:G88品系成蟲Adult of strain G88;GL:G88品系幼蟲Larva of strain G88.不同小寫字母表示拷貝數(shù)在不同樣本間差異顯著(P<0.05,Tukey HSDa檢驗(yàn))。Different lowercase letters indicate significant differences in the gene copy number among different samples (P<0.05,Tukey HSDa test).

2.5 PxERV的獨(dú)立復(fù)制活性

為探究內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的獨(dú)立復(fù)制活性，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)共注射小菜蛾260顆卵，成活120頭，送測G0代100頭，突變率達(dá)60%，絕大多數(shù)突變蟲自交后代的檢測序列在突變區(qū)的同一位點(diǎn)有3種以上的堿基信號(圖5:A)，說明蟲體中含多種突變類型；在送測小菜蛾中篩得1頭只含在312和313位點(diǎn)有兩堿基突變(圖5:A)的雌蟲，其后代連續(xù)自交、測序發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2代(圖5:C)突變型堿基信號的峰高相對F1代(圖5:B)變小，自交多代后無法測到突變型堿基信號，說明自交多代，突變型env基因在小菜蛾基因組上不斷減少，直至消失，純合野生型env基因恢復(fù)。

圖5 env基因檢測片段的堿基信號圖(局部)Fig.5 The base signal of partial env gene sequence堿基信號Base signal:C:藍(lán)色Blue;G:黑色Black;T:紅色Red;A:綠色Green

3 討論

本研究中，我們在小菜蛾基因組中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒元件，長8 343 bp，具有LTR-pol-env-LTR結(jié)構(gòu)(圖1)。通常認(rèn)為昆蟲內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的侵染能力與env基因的表達(dá)相關(guān)(Teyssetetal.,1998)，所以對內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒env基因的特征分析，有利于全面了解該內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒。

缺乏env基因的LTR轉(zhuǎn)座子可以通過整合到桿狀病毒的雙鏈DNA基因組中從桿狀病毒中“捕獲”env基因(Maliketal.,2000)。并且，還有報(bào)道發(fā)現(xiàn)與桿狀病毒GroupⅡ的融合蛋白具有顯著同源性的昆蟲內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的env蛋白有融合活性(Rohrmann and Karplus,2001;Misserietal.,2003,2004)。桿狀病毒家族有兩類包膜糖蛋白，分別為gp64和F。通常，桿狀病毒GroupⅠ含有g(shù)p64和F蛋白，而桿狀病毒GroupⅡ只含有F蛋白(Pearson and Rohrmann,2002)。通過對昆蟲內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒env蛋白序列和幾種昆蟲核型多角體病毒的包膜糖蛋白序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，昆蟲內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒env基因的蛋白序列與昆蟲核型多角體病毒的包膜糖蛋白序列明顯分為兩支，符合內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒是古外源逆轉(zhuǎn)錄病毒在宿主基因組中的殘余這一猜想(L?weretal.,1996)。本研究中的PxERV與粉紋夜蛾內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒Ted和果蠅逆轉(zhuǎn)座子osvaldo的env基因進(jìn)化關(guān)系最近(圖2)，我們猜測PxERV可能在早期已整合到昆蟲某祖先基因組中，世代留存并不斷分化，或者在很早之前，PxERV與Ted和osvaldo分別從某一種寄生在昆蟲上的桿狀病毒中“捕獲”了同一段env基因。

昆蟲內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒ZAM屬于gypsy家族，在果蠅的生殖系中可通過RNA中間體實(shí)現(xiàn)世代間的轉(zhuǎn)移，其侵染性在果蠅的不同品系中是不一樣的，造成拷貝數(shù)和插入位點(diǎn)有顯著差異(Leblancetal.,1997)。本研究env基因的突變檢測發(fā)現(xiàn)同一蟲體內(nèi)可包含多種突變類型(圖5:A)，說明PxERV在小菜蛾基因組上是多拷貝存在的；突變后的env基因多代自交過程中在基因組上不斷減少，最終恢復(fù)為野生型，說明PxERV在小菜蛾世代間有獨(dú)立復(fù)制活性；env基因拷貝數(shù)的量化檢測發(fā)現(xiàn)PxERV在福州敏感品系(FZ)中的基因拷貝數(shù)低于在G88品系中的拷貝數(shù)，但G88品系不同發(fā)育齡期間的拷貝數(shù)沒有顯著差異(圖4)，說明PxERV在小菜蛾個(gè)體發(fā)育過程中不發(fā)生獨(dú)立復(fù)制，并且獨(dú)立復(fù)制能力在不同品系間有差異。另有研究發(fā)現(xiàn)ZAM的全長RNA與gag和env基因在卵母細(xì)胞周圍的泡細(xì)胞中協(xié)同表達(dá)，組裝成顆粒進(jìn)入卵母細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)ZAM在果蠅中的世代轉(zhuǎn)染(Leblancetal.,2000)。我們研究發(fā)現(xiàn)PxERV的env基因在成蟲精巢中特異性高表達(dá)(圖3)，我們猜測PxERV可能是在成蟲精巢中進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，通過小菜蛾雄性生殖系統(tǒng)完成世代侵染。這一猜測還需進(jìn)一步的驗(yàn)證，其世代侵染的分子機(jī)制也需進(jìn)一步的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)小菜蛾內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒元件，揭示了它有獨(dú)立的復(fù)制活性，為進(jìn)一步研究內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒對小菜蛾的影響奠定了基礎(chǔ)，也促進(jìn)了昆蟲內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒領(lǐng)域的研究，有利于研究內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒對宿主的生物學(xué)意義。