田 青， 王海平， 黃和升， 梁天林， 李 萌

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003；2.江蘇大川生物科技有限公司，江蘇淮安223003）

研究發(fā)現(xiàn)INS、PRL和HYD等激素可以調(diào)節(jié)乳蛋白的合成 （Pauloin等，2012；Xudong等，2011；Burgos等，2010）。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果也表明，INS、PRL和HYD單獨(dú)或聯(lián)合作用都能增加奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖和促進(jìn)乳蛋白的合成（田青等，2014、2013），并且田青等（2016、2015）還證明這種調(diào)節(jié)作用主要是通過mTOR和JAKSTAT信號通路發(fā)揮的。Qian（2009）和Burgos（2010）提出AG-490是一種對JAK2激酶選擇性抑制的抑制劑，能夠阻止JAK2-STAT5A信號通路作用的發(fā)揮。Pauloin等（2012）提出LY294002是一種PI3K激酶選擇性抑制劑，能夠抑制mTOR信號通路作用的發(fā)揮。為了確定前期研究結(jié)果在體內(nèi)和體外是否一致，本試驗(yàn)選用泌乳期Wistar大鼠作為試驗(yàn)動物，分別選用LY294002和AG-490來抑制mTOR和JAK-STAT信號通路，然后通過對新生仔鼠的平均日增重、泌乳大鼠平均產(chǎn)奶量、大鼠乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、血漿和乳腺組織中激素和蛋白基因的表達(dá)等指標(biāo)的測定來進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物 從揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究中心購買平均體重為（200±20）g的Wistar大鼠，采用12 h光照，12 h黑暗的交替光照控制法，在相對溫度15～20℃，相對濕度50%～70%的條件下飼養(yǎng)，全程自由飲水，自由采食。

1.2 試驗(yàn)處理 經(jīng)過3 d的產(chǎn)后修復(fù)，母鼠連同出生仔鼠以窩為單位隨機(jī)分為4個組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)6窩，每窩一只母鼠，6只仔鼠。從第4天開始，對照組母鼠每隔1天定時（早晨8：00）肌肉注射生理鹽水2 mL，試驗(yàn)組母鼠每隔1天定時（早晨8：00）分別按照表1的設(shè)計方案肌肉注射2 mL，試驗(yàn)期14 d。每天記錄大鼠的泌乳量和仔鼠日增重。

表1 試驗(yàn)設(shè)計

1.3 大鼠平均泌乳量的測定 參照Silberstein（1987）的方法進(jìn)行，即以窩為單位，每天早晨8：00將仔鼠與母鼠分開，4 h后以窩為單位稱重仔鼠，之后立刻放回到母鼠身邊開始哺乳，60 min后再次以窩為單位稱重仔鼠 （在此期間仔鼠禁食禁水），兩次稱重的體重差即大鼠平均泌乳量。

1.4 仔鼠平均日增重的測定 試驗(yàn)期末仔鼠窩平均體重與試驗(yàn)始仔鼠窩平均體重的差除以試驗(yàn)期天數(shù)（14）即得仔鼠平均日增重。

ADG/g=[試驗(yàn)期末仔鼠窩平均體重 （g）-試驗(yàn)始仔鼠窩平均體重 （g）]/14。

1.5 血漿和組織樣的收集與準(zhǔn)備 最后1次泌乳量測定完成后，母鼠用10%水合氯醛以10 mL/kg體重的劑量腹腔注射麻醉，之后心臟采血5 mL，4000 r/min離心15 min，收集血漿，分裝后-20℃保存。采血后，立即采集右側(cè)靠近尾部的三對乳腺組織，液氮保存，用于測定組織蛋白含量。收集左側(cè)腹股溝處最大的乳腺組織，10%的中性甲醛固定，用于大鼠乳腺組織形態(tài)學(xué)測定。

1.6 大鼠乳腺組織切片的制備 固定：無菌采取乳腺組織樣本后立即轉(zhuǎn)移至含有5 mL 10%中性甲醛無菌試管固定24 h，然后將組織轉(zhuǎn)移至另外一只含有5 mL 10%中性甲醛的試管中保存。

脫水：固定后的組織分別在70%、80%和90%的酒精中連續(xù)脫水3 h。

透明：脫水后的組織先轉(zhuǎn)移至二甲苯溶液中20 min，然后用新鮮的二甲苯溶液重復(fù)孵育20 min。

透蠟：二甲苯處理后的組織轉(zhuǎn)移至65℃溶解石蠟中包埋40 min，然后重復(fù)此操作1次。

包埋：將浸蠟后的組織轉(zhuǎn)移至溶解的石蠟?zāi)ゾ咧?，使之迅速凝固成蠟塊。

切片：用顯微鏡薄片切片機(jī)將石蠟包埋的組織切成3～4 μm的薄片，將薄片放入溫水（40 ℃）中展開并小心轉(zhuǎn)移至載玻片上，自然晾干。

染色：將干燥的切片放入二甲苯溶液中5～10 min，如此再重復(fù)一次，溶去切片上的石蠟，隨后將切片依次放入無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min后即可按照蘇木精和HE染色試劑的說明書進(jìn)行染色。切片先用蘇木精染液染色5～10 min，進(jìn)入自來水10 min，隨后用蒸餾水洗去殘留的染液。接著用95%乙醇潤洗5 s，伊紅染色0.5～2 min，70%乙醇潤洗后用95%乙醇脫色2次，每次2 min。隨后，二甲苯清洗2次，每次5 min。最后，用中性橡膠密封切片，用顯微鏡觀察。藍(lán)色為細(xì)胞核，粉紅色或紅色為胞質(zhì)。

1.7 大鼠乳腺組織和血漿中酪蛋白和激素含量的測定 用上海碧云天公司增強(qiáng)型BCA蛋白測定試劑盒，根據(jù)其說明書對液氮中保存的大鼠乳腺組織進(jìn)行處理，總蛋白、總酪蛋白和κ-酪蛋白的含量用上海悅顏生物有限公司大鼠總蛋白、總酪蛋白和κ-酪蛋白ELISA試劑盒進(jìn)行測定。INS、PRL和HYD水平也用上海悅顏生物有限公司的ELISA試劑盒進(jìn)行測定。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SAS 9.1軟件中單因素方差分析和Tukey法進(jìn)行多重比較。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源激素和抑制劑對泌乳期大鼠乳腺組織形態(tài)的影響 與對照組相比，PRL、HYD和INS三種激素聯(lián)合作用組細(xì)胞呈典型的圓形和橢圓形，細(xì)胞大小均勻，乳導(dǎo)管分布明顯，說明三種激素聯(lián)合作用對泌乳期大鼠乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)無顯著影響，但是細(xì)胞信號通路抑制劑LY294002和AG-490添加組細(xì)胞形態(tài)不完整，乳導(dǎo)管分布也不規(guī)則，推測可能是抑制劑對正常細(xì)胞的形態(tài)損傷造成的。

2.2 外源激素和抑制劑對泌乳期大鼠平均泌乳量和新生仔鼠平均日增重的影響 由表2可見，與對照組相比，激素組合與兩種抑制劑對泌乳期大鼠平均泌乳量和平均日增重的影響差異不顯著（P＞0.05）。但是，在各試驗(yàn)組之間，8 d和14 d時試驗(yàn)3組母鼠的平均泌乳量比試驗(yàn)1組分別增加20.75%和7.04%，比試驗(yàn)2組分別增加了 13.65%和 8.84%（P ＜ 0.05）；10 d時，試驗(yàn)3組仔鼠平均日增重較試驗(yàn)2組降低了45.81%（P ＜ 0.05）。

2.3 外源激素和抑制劑對泌乳期大鼠血漿總蛋白和激素水平的影響 由圖1可見，與對照組相比，激素組合與兩種抑制劑對泌乳期大鼠血漿總蛋白含量的影響差異不顯著（P＞0.05），但各試驗(yàn)組血漿總蛋白水平均低于對照組。

表2 新生仔鼠平均日增重和泌乳大鼠平均泌乳量分析

由圖2～圖4可見，與對照組相比，試驗(yàn)1、2、3組血漿INS水平分別降低3%、4.98%和4.12%，試驗(yàn) 1、2、3組血漿 HYD水平分別降低 3.07%、5.04%和4.17%，而試驗(yàn)1、2、3組血漿PRL水平分別降低3.75%、4.66%和4.45%（P＜0.05）。各試驗(yàn)組之間，血漿催乳素水平差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 外源激素和抑制劑對泌乳期大鼠乳腺組織酪蛋白含量的影響 由圖5可見，與對照組相比，試驗(yàn)1、2、3組對大鼠乳腺組織中總蛋白含量的影響差異不顯著 （P=0.071），但在各試驗(yàn)組之間，試驗(yàn)2、3組大鼠乳腺組織中總蛋白含量低于試驗(yàn)1組，降低了20.79%和30.94% （P＜0.05）。

由圖6和圖7可見，與對照組相比，不管是激素的復(fù)合作用還是抑制劑，均顯著降低了大鼠乳腺組織中k-酪蛋白和總酪蛋白的含量，其中試驗(yàn)1、2、3組組織中k-酪蛋白的含量與對照組相比分別降低了4.06%、3.28%和3.01%，組織中總酪蛋白含量與對照相比分別降低了4.48%、3.47%和3.07%（P＜0.05），但各試驗(yàn)組之間差異均不顯著（P＞0.05）。

2.5 外源激素和抑制劑對泌乳期大鼠乳腺組織激素水平的影響 由圖8～圖10可見，與對照組相比，不管激素復(fù)合作用還是抑制劑，均對大鼠乳腺組織中催乳素水平無顯著影響（P＞0.05），但均顯著降低了乳腺組織中胰島素的水平，試驗(yàn)1、2、3組與對照組相比分別降低了11.62%、11.26%和6.41%（P ＜ 0.05），對氫化可的松而言，AG-490抑制劑顯著增加了乳腺組織中HYD水平，與對照組相比增加了2.69%（P＜0.05），其他各組間差異不顯著（P ＞ 0.05）。

3 討論

3.1 外源激素和抑制劑抑制了大鼠乳腺組織中乳蛋白的合成 試驗(yàn)研究結(jié)果表明，外源激素和抑制劑對大鼠血漿總蛋白含量無影響，卻顯著降低了血漿激素含量。在乳腺組織中，除外源激素的聯(lián)合作用對乳腺總蛋白含量略有上升外，外源激素和抑制劑均顯著降低了大鼠乳腺組織中總酪蛋白和k-酪蛋白的含量，與Tian等（2015）研究結(jié)果看似不一樣但卻也不矛盾。其原因可能是，體外研究的環(huán)境較為單一，基本上是在無任何其他激素干擾而僅僅聚焦于待研究激素的情況下，而體內(nèi)的情況更復(fù)雜，對于本試驗(yàn)所選擇的健康泌乳期的大鼠，本身就具有相對平衡和強(qiáng)大調(diào)節(jié)功能的內(nèi)源激素系統(tǒng)，在外源激素和抑制劑注射后反而會影響機(jī)體固有內(nèi)分泌系統(tǒng)的平衡。因此，在機(jī)體固有內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)下，為了維持這種平衡會額外消耗蛋白合成的前體物、能量而造成原有內(nèi)分泌系統(tǒng)的短暫紊亂，這就導(dǎo)致了血漿總蛋白、k-酪蛋白和組織蛋白含量的顯著下降。

Tian 等（2016）研究結(jié)果表明，LY294002 可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡，同時也會下調(diào)mTOR信號通路和JAK-STAT信號通路中相關(guān)基因和激素受體基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制CSN3基因的表達(dá)，這和本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)中血漿和乳腺組織中激素水平的變化情況也驗(yàn)證了蛋白質(zhì)水平變化的結(jié)果和分析。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，外源激素和抑制劑均顯著降低了泌乳期大鼠血漿中的激素水平，使乳腺的激素水平更加雜亂。與對照組相比，除AG-490顯著增加了乳腺組織中氫化可的松水平外，外源激素和抑制劑對其他組催乳素和氫化可的松含量影響不大，但對胰島素，外源激素和抑制劑依然顯著降低了其在乳腺組織中的水平，這和蛋白質(zhì)層面的試驗(yàn)結(jié)果正好呼應(yīng)。因此，建議在動物疾病或機(jī)體代謝紊亂的情況下，可以通過注射外源性激素來調(diào)節(jié)內(nèi)源性激素的平衡；而在健康動物的正常生理水平下，則無需外援干涉。

3.2 抑制劑顯著破壞了大鼠乳腺組織結(jié)構(gòu) 乳腺是產(chǎn)乳和乳蛋白合成的主要場所。腺泡是乳腺的實(shí)質(zhì)部分，是乳腺的功能單位，在乳蛋白的合成和分泌、乳汁的排出等過程中起作用，可將血液中的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳汁。此外，Silberstein（1987）和Yang（2005）發(fā)現(xiàn)，乳腺間質(zhì)具有保護(hù)和支持乳腺組織的功能，其發(fā)育和功能狀態(tài)直接影響哺乳動物的產(chǎn)乳和產(chǎn)奶質(zhì)量。在妊娠期和哺乳期，多種生長因子、激素和細(xì)胞外基質(zhì)參與調(diào)節(jié)乳腺細(xì)胞的增殖、分化和泌乳。本試驗(yàn)結(jié)果表明，外源激素組細(xì)胞呈典型的圓形和橢圓形，細(xì)胞大小均勻，乳導(dǎo)管分布明顯，說明其對泌乳期大鼠乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)無顯著影響，但是LY294002和AG-490組細(xì)胞形態(tài)不完整，乳導(dǎo)管分布也不規(guī)則。結(jié)合泌乳大鼠血漿和乳腺組織的激素分泌情況，推測產(chǎn)生此結(jié)果的可能原因是抑制劑組是在額外添加外源激素的同時添加抑制劑，外源激素單獨(dú)作用雖然造成了健康的泌乳期大鼠內(nèi)分泌的紊亂，但還沒有達(dá)到損傷乳腺組織的程度，而抑制劑組在造成了內(nèi)分泌紊亂的同時，還造成轉(zhuǎn)錄水平或蛋白翻譯水平的部分中斷，致使乳腺組織結(jié)構(gòu)受到損傷。 Brisken（1999）和 Clevenger（2003）等多項研究表明，哺乳動物的PRL可以通過自分泌和旁分泌信號調(diào)節(jié)乳腺發(fā)育，進(jìn)而促進(jìn)泌乳和維持泌乳。對于乳腺形態(tài)，F(xiàn)reeman（2000）和 BoleFeysot（1998）等研究表明，PRL不僅間接控制未孕小鼠的導(dǎo)管分支和終末芽的降解，還控制乳腺上皮細(xì)胞促進(jìn)小葉腺泡的發(fā)育。這些結(jié)果也在一定程度上驗(yàn)證了上述結(jié)果，說明抑制劑破壞正常乳腺形態(tài)的作用是導(dǎo)致酪蛋白含量下降的另一個主要原因。此分析也可能從泌乳大鼠的泌乳量和新生仔鼠平均日增重的結(jié)果得到驗(yàn)證。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在各試驗(yàn)組之間，LY294002顯著增加了不同時期母鼠的平均泌乳量，卻顯著降低了試驗(yàn)?zāi)┳惺蟮钠骄赵鲋?，說明由于乳腺組織損傷、乳腺中蛋白質(zhì)組成的改變導(dǎo)致乳品質(zhì)的下降，進(jìn)而造成了新生仔鼠平均日增重的顯著降低。

4 結(jié)論

對于泌乳期某種激素缺乏的情況下，外源激素的添加或許可以提高乳蛋白的合成，但是外源激素和抑制劑對健康的泌乳期大鼠乳蛋白合成，尤其是酪蛋白的合成反而不利。因此，對健康的泌乳期動物，不建議使用外源激素進(jìn)行干預(yù)。