馬水燕,王楠楠,董雨豪,劉錦,陸承平,劉永杰

(南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,江蘇 南京 210095)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是廣泛存在于水體環(huán)境中的革蘭陰性菌,可引起淡水魚的出血性敗血癥,也可感染人引發(fā)胃腸炎和敗血癥[1]。該菌的致病性與其產(chǎn)生的多種毒力因子如胞外蛋白酶、溶血素及外膜蛋白等密切相關(guān)[2]。此外,Ⅵ型分泌系統(tǒng)(type Ⅵ secretion system,T6SS)也是嗜水氣單胞菌重要的毒力因子[3]。

T6SS廣泛存在于革蘭陰性菌中,對細菌的致病性和環(huán)境適應性有重要作用。功能性的T6SS一般是由13個保守的“核心”基因編碼的蛋白組裝成類似于倒置T4噬菌體的復雜結(jié)構(gòu),可以錨定在細胞膜上,通過分泌效應蛋白到原核細胞或真核細胞發(fā)揮毒力作用[4]。效應蛋白的種類和功能復雜,通常使用質(zhì)譜分析、蛋白組學和突變體庫等方法鑒定。目前研究最多的是溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(Hcp)和纈氨酸谷氨酸重復蛋白(VgrG)[5],它們也是重要的結(jié)構(gòu)蛋白。近年來隨著生物信息學技術(shù)的不斷發(fā)展,利用一些特征基因簇或保守結(jié)構(gòu)域如脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸(PAAR)重復蛋白[6]、未知功能結(jié)構(gòu)域4123(DUF4123)[7]等,已成功鑒定到多種效應蛋白。Russell等[8]通過保守催化基序GxSxG鑒定出具有脂酶活性的效應蛋白,命名為Ⅵ型脂酶效應蛋白(Tle),并將其劃分為4個家族,即Tle1—Tle4。

嗜水氣單胞菌NJ-35株于2010年分離自江蘇省南京市浦口區(qū)某漁場的發(fā)病鯽魚,基因序列比對發(fā)現(xiàn)其基因組內(nèi)有完整的T6SS基因簇。本課題組前期工作主要集中于Hcp蛋白的功能研究[9],未對其他潛在的效應蛋白進行鑒定。本研究利用生物信息學方法,在NJ-35基因組中尋找保守結(jié)構(gòu)域,通過保守結(jié)構(gòu)域預測到假定的T6SS效應蛋白Tle1AH,進一步構(gòu)建基因缺失株及互補株,并測定其競爭能力、生長特性及毒力,研究結(jié)果為深入探討嗜水氣單胞菌T6SS致病機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與試劑

嗜水氣單胞菌NJ-35、大腸桿菌SM10由本課題組分離保存;自殺性質(zhì)粒pYAK1、pMMB207由浙江大學方維煥教授饋贈。Prime STAR DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA fragment Purification Kit均購自大連TaKaRa公司;細菌質(zhì)粒提取試劑、E.Z.N.A.TM細菌RNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司;DNA Marker、DNA Gel Purification Kit、2×PCR Pre Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司;氨芐青霉素(Amp)、氯霉素(Cm)、卡那霉素(Kan)均為Invitrogen產(chǎn)品。試驗相關(guān)引物(表1)由蘇州金唯智科技有限公司合成。

表1 本試驗所用引物信息

1.2 T6SS效應蛋白的預測

參考已報道的保守結(jié)構(gòu)域DUF4123,對NJ-35株的全基因組序列進行潛在的T6SS效應蛋白搜索。使用Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線軟件預測特殊的結(jié)構(gòu)域,利用Geneious軟件人工比對催化基序生成序列標識。

1.3 基因缺失株的構(gòu)建

利用同源重組技術(shù)構(gòu)建基因缺失株[10]。以NJ-35株基因組為模版,用上游片段引物(P1/P2)和下游片段引物(P3/P4)分別擴增目的基因的上、下游同源臂。以上、下游產(chǎn)物為模版,使用P1/P4引物融合上、下游同源臂,再利用常規(guī)的酶切、連接,將融合片段連接到pYAK1載體并轉(zhuǎn)化宿主菌SM10。測序鑒定后進行下一步試驗。

以含有自殺重組質(zhì)粒的大腸桿菌SM10為供體菌,嗜水氣單胞菌NJ-35為受體菌,通過菌毛接合的方式將重組質(zhì)粒從SM10轉(zhuǎn)移至NJ-35中。具體方法:2種菌均培養(yǎng)至對數(shù)生長期,5 000g離心5 min后棄上清液;用新鮮LB液體培養(yǎng)基洗2次,將2種菌濃度均調(diào)至1.0×108CFU·mL-1(A600=0.2),按照2∶1(體積比)的比例將SM10與NJ-35充分混勻。各取200 μL混合菌液滴加在鋪有0.45 μm孔徑無菌濾膜的LB固體培養(yǎng)基上,平板正放于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

無菌鑷子取出帶菌濾膜,吹打至1 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基,5 000g離心5 min,棄800 μL上清液,其余菌液涂布于含氨芐青霉素(Amp,100 μg·mL-1)和氯霉素(Cm,34 μg·mL-1)雙抗的LB平板上,28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～36 h。挑取單菌落于含有上述2種抗生素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜,提取基因組后用P1/P4引物進行PCR鑒定,篩選第1次同源重組的菌株(單交換株)。

單交換株轉(zhuǎn)接至不含NaCl的LB培養(yǎng)基中,傳代3次后轉(zhuǎn)接至含200 g·L-1蔗糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h,菌液涂布含200 g·L-1蔗糖的LB固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后挑取單菌落于普通LB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)6～8 h,提取基因組并進行PCR驗證,篩選第2次同源重組后丟失目的基因的菌株,即基因缺失株Δtle1AH。

1.4 基因互補株的構(gòu)建

以NJ-35株基因組為模版,用互補片段引物(P5/P6)進行PCR擴增,獲得含有目的基因的片段,通過常規(guī)單酶切、連接、轉(zhuǎn)化,將片段產(chǎn)物連接到質(zhì)粒pMMB207(宿主菌為大腸桿菌SM10)。以含有互補質(zhì)粒的大腸桿菌SM10為供體菌,NJ-35株基因缺失株為受體菌,通過細菌接合將互補質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至缺失株。接合完成后,用無菌鑷子取出帶菌濾膜,用1 mL新鮮的LB將濾膜上的菌體吹打至離心管中,5 000g離心 5 min,棄800 μL上清液,菌體重懸后涂布于含有雙抗(100 μg·mL-1Amp,34 μg·mL-1Cm)的LB平板上,倒置于28 ℃培養(yǎng)36～48 h。挑取單菌落于含有雙抗的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,提取基因組進行PCR驗證,篩選含有互補質(zhì)粒的菌株,即基因互補株CΔtle1AH。

1.5 RT-qPCR檢測

取對數(shù)生長期的野生株、缺失株及互補株的菌液,提取細菌RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄(RT)為 cDNA,采用SYBRPremixExTaqTMKit進行qPCR,用tle1AH-RT-S/A引物檢測各菌株基因轉(zhuǎn)錄水平,并以aetY-RT-S/A作為內(nèi)參引物,采用2-ΔΔCT法計算各基因相對轉(zhuǎn)錄水平[11]。試驗重復3次。

1.6 生長曲線的測定

分別挑取野生株、缺失株和互補株的單菌落于LB液體培養(yǎng)基,28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜。各菌株A600值調(diào)至0.5,以1∶100的比例轉(zhuǎn)接至20 mL LB液體培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)。每隔 2 h 取3個平行樣本,測定A600值,繪制生長曲線。

1.7 生物被膜形成能力和運動性測定

參考已報道的方法[12],挑取各菌株單菌落接種LB液體培養(yǎng)基,28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)過夜。取菌液按1∶100轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期,用LB培養(yǎng)基將A600值調(diào)至0.1后再稀釋100倍。制備好的菌液按每孔200 μL加入無菌的96孔平底細胞板中,每株菌重復8孔。同時加8孔新鮮LB液體培養(yǎng)基作為陰性對照。細胞板在28 ℃靜置培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)上清液,用無菌PBS清洗3次除去浮游菌體。然后,每孔加入200 μL甲醇固定菌體,15 min后棄去,室溫下干燥。向每孔加200 μL 0.1%結(jié)晶紫染色,10 min后棄去并用ddH2O清洗5次。待完全干燥后向各孔加無水乙醇200 μL,溶解10 min,最后用酶標儀測定A595值。試驗重復3次。

將上述A600=0.1的菌液各取1 μL輕輕垂直點于瓊脂含量3 000 mg·L-1的LB培養(yǎng)基表面,在28 ℃靜置培養(yǎng)24 h后測量細菌圓形運動軌跡的直徑。試驗重復3次。

1.8 細菌競爭試驗

嗜水氣單胞菌與大腸桿菌的競爭試驗參照Macintyre等[13]的方法進行。嗜水氣單胞菌NJ-35株有Amp抗性,大腸桿菌BL21含有pET-28a(+)載體,帶有卡那霉素抗性(Kanr)。2種菌分別培養(yǎng)至對數(shù)生長期后將A600值調(diào)為1.0,再濃縮至原來體積的1/10,將嗜水氣單胞菌各菌株菌液(5×109CFU·mL-1)與大腸桿菌菌液(5×109CFU·mL-1)按1∶1充分混勻,各取25 μL滴加于LB平板上的0.22 μm濾膜;同時LB液體培養(yǎng)基和等量大腸桿菌混勻作為對照。平板置于28 ℃溫箱培養(yǎng)3 h。取出帶菌濾膜,用1 mL LB液體培養(yǎng)基沖洗收集的菌體并倍比稀釋。取100 μL合適稀釋度菌液涂布于含有Kan抗性的LB平板培養(yǎng)并計數(shù)。試驗重復3次。

1.9 小鼠巨噬細胞吞噬試驗

參照Dong等[14]的方法,將小鼠巨噬細胞RAW264.7按每孔4×105的細胞量接種于24孔細胞培養(yǎng)板中,置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待細胞長成單層后以PBS洗滌細胞3次后,加入400 μL DMEM待用,同時計數(shù)每孔中的細胞數(shù)量。取處于對數(shù)生長期各菌株菌液,4 000g離心5 min,取沉淀用無菌PBS洗3次。向每孔細胞中加入100 μL細菌(4×106CFU·mL-1),使細菌與細胞的感染比例為1∶1,加入細菌后,800g離心細胞板10 min,使細菌集中到細胞表面。同時把菌懸液10倍比梯度稀釋后進行平板計數(shù),以確定實際加入每孔的細菌量。將細胞板置于28 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1 h,無菌PBS洗滌5次,加入含有100 μg·mL-1慶大霉素的DMEM,置于28 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h,無菌PBS洗滌5次,然后加入1 mL細胞裂解液室溫裂解細胞10 min,吹打混勻,10倍比梯度稀釋后涂LB固體平板,取菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)。試驗重復3次。

1.10 對斑馬魚半數(shù)致死量(LD50)的測定

LD50的測定參照Pang等[15]的方法。斑馬魚在室內(nèi)喂養(yǎng)1周并觀察狀態(tài),確認良好后進行試驗。水溫保持在25～28 ℃。挑取各菌株單菌落于LB培養(yǎng)基中28 ℃過夜培養(yǎng),再1∶100轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期,5 000g離心后棄上清液,菌體用無菌PBS洗3次,將菌液濃度分別調(diào)整為5×106、5×105、5×104、5×103、5×102CFU·mL-1。每個濃度注射10尾斑馬魚,每尾0.02 mL,同時注射等量PBS設(shè)為空白對照。觀察記錄1周,按照Bliss算法[16]計算LD50。

1.11 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計分析采用Microsoft Excel 2013和Graphpad prism 5軟件進行數(shù)據(jù)處理。用t測驗法進行組間差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用DUF4123結(jié)構(gòu)域預測潛在效應蛋白

以DUF4123保守結(jié)構(gòu)域作為靶點,在嗜水氣單胞菌NJ-35株中預測到潛在的效應蛋白基因(圖1-A),發(fā)現(xiàn)該基因編碼具有水解酶活性的DUF2235結(jié)構(gòu)域,蛋白氨基酸序列含有典型的磷酸酶GxSxG催化位點(圖1-B),符合已鑒定效應蛋白Tle磷脂酶家族的特點,命名為Tle1AH。

2.2 tle1AH基因缺失株和互補株的PCR鑒定及tle1AH基因轉(zhuǎn)錄的qPCR驗證

重組缺失質(zhì)粒和互補質(zhì)粒序列經(jīng)NCBI BLAST在線比對,確認沒有堿基突變。用引物P1/P4對野生株和缺失株進行PCR驗證,野生株檢測到3 399 bp大小的產(chǎn)物,缺失株產(chǎn)物大小為1 401 bp,即成功缺失了1 998 bp目的片段。用目的基因內(nèi)部引物P5/P6進一步驗證,缺失株中不能檢測到條帶,而野生株有擴增產(chǎn)物,說明成功構(gòu)建了tle1AH單基因缺失株(圖2-A)。用互補引物進行PCR驗證,結(jié)果表明在互補株中可以檢測到目的基因,說明tle1AH基因回補成功(圖2-B)。連續(xù)傳10代后再次經(jīng)PCR檢測,未發(fā)生回復突變。

采用qPCR對野生株、缺失株Δtle1AH和互補株CΔtle1AH進行目的基因轉(zhuǎn)錄分析。結(jié)果顯示,Δtle1AH株無目的基因轉(zhuǎn)錄,而野生株和互補株中均有一定水平的轉(zhuǎn)錄(圖2-C)。

2.3 菌株的生長曲線和運動性測定

NJ-35、Δtle1AH、CΔtle1AH在28 ℃條件下生長速率(圖3-A)和運動性(圖3-B)沒有明顯差異,說明敲除tle1AH基因并不影響嗜水氣單胞菌在LB培養(yǎng)基中的生長能力和運動性。

2.4 菌株的競爭能力驗證

用大腸桿菌與嗜水氣單胞菌各菌株分別共培養(yǎng),檢測大腸桿菌存活數(shù)。結(jié)果顯示:與NJ-35株共培養(yǎng)時,存活的大腸桿菌數(shù)量顯著降低;同時tle1AH基因的缺失顯著降低了NJ-35對大腸桿菌生長的抑制能力(P<0.01),而互補株CΔtle1AH又能恢復到野生株的抑制水平(圖4)。表明Tle1AH在嗜水氣單胞菌抑制其他細菌生長過程中起重要作用。

2.5 生物被膜形成能力測定

與野生株比較,缺失株的生物被膜形成能力顯著上升(P<0.05)(圖5),提示該基因除了參與細菌競爭活動外,也參與調(diào)控生物被膜形成。

2.6 巨噬細胞吞噬試驗

巨噬細胞RAW264.7吞噬試驗結(jié)果(圖6)表明:RAW264.7細胞對野生株和互補株的吞噬率分別為9%和8%,顯著低于對缺失株的吞噬率(38.7%)(P<0.05),說明tle1AH缺失可導致嗜水氣單胞菌抗吞噬能力明顯降低。

2.7 菌株對斑馬魚LD50的測定

試驗組感染細菌24 h后開始出現(xiàn)死亡,對照組斑馬魚在試驗過程中均活動正常,未出現(xiàn)臨床癥狀和死亡情況。發(fā)病的魚出現(xiàn)典型的臨床癥狀,身體側(cè)翻,腹部及鰭條明顯充血、出血,繼而死亡。對病死魚進行細菌分離鑒定,確定為嗜水氣單胞菌感染。統(tǒng)計各試驗組斑馬魚在 1周內(nèi)的死亡數(shù)量,按照Bliss法計算出野生株NJ-35的LD50值約為4.40×103CFU,缺失株Δtle1AH的LD50約為7.41×104CFU,互補株CΔtle1AH的LD50約為7.48×103CFU(圖7)。表明tle1AH基因在嗜水氣單胞菌NJ-35株毒力上發(fā)揮重要作用。

3 討論

細菌為了克服從胞質(zhì)向胞外轉(zhuǎn)運蛋白的困難,進化出多種不同類型的蛋白分泌系統(tǒng)。革蘭陰性菌中至少存在6種蛋白分泌系統(tǒng)(T1SS—T6SS),其中分布廣泛的T6SS在細菌的致病和環(huán)境適應過程中發(fā)揮重要作用[17]。目前已經(jīng)鑒定的效應蛋白種類和功能復雜,基于作用靶標分為3類,分別靶向細胞壁、細胞膜和核酸[18]。Tle1—Tle4家族除了保守的催化基序外,與其他已知的脂肪酶無明顯的序列同源性。本研究分析AH17550的氨基酸序列,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有GxSxG催化基序,且在其C端存在T6SS效應蛋白常見的DUF2235結(jié)構(gòu)域[19],該基因上游還存在目前公認的效應蛋白基因hcp和VgrG,因此推測AH17550很可能是一種潛在的脂質(zhì)水解酶型T6SS效應分子,將其命名為Tle1AH。

為進一步分析tle1AH基因的功能,本試驗成功構(gòu)建tle1AH缺失株及相應互補株,并對其生物學特性進行分析。tle1AH缺失后,嗜水氣單胞菌對大腸桿菌生長的抑制能力顯著降低,提示該基因參與細菌種間競爭,從而有助于增強細菌自身的環(huán)境適應性。此外,tle1AH缺失可導致嗜水氣單胞菌抗巨噬細胞的吞噬能力及對斑馬魚的毒力作用均明顯降低,表明tle1AH在該菌致病過程中發(fā)揮重要作用。有研究報道,Hcp和VgrG作為嗜水氣單胞菌SSU(現(xiàn)已更名為達卡氣單胞菌SSU)的重要T6SS效應蛋白,除參與環(huán)境競爭外,還參與調(diào)控細菌的運動性、生物被膜形成及毒力特性[20]。Gallique等[21]研究表明,T6SS效應蛋白的缺失可導致銅綠假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)生物被膜形成能力下降。本試驗中tle1AH缺失則引起嗜水氣單胞菌NJ-35的生物被膜形成能力明顯增強,但不影響細菌的運動性。這些研究結(jié)果的差異可能與菌株的不同或效應蛋白種類不同有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),NJ-35的T6SS效應蛋白Hcp有3個基因拷貝,在生物被膜形成能力上發(fā)揮不同的作用:hcp1和hcp2基因缺失會導致生物被膜形成能力降低,而hcp3缺失則導致生物被膜形成能力增強[22]。因此,推測T6SS多種效應蛋白在調(diào)控嗜水氣單胞菌生物被膜形成上可能存在相互協(xié)調(diào)作用。

效應蛋白有一定的毒性作用,細菌為了避免對自身細胞的傷害,通常會在其下游編碼特異性同源免疫蛋白,從而中和毒素效應[23]。本研究同樣在tle1AH基因下游預測到編碼假定免疫蛋白的基因。后續(xù)將著重研究tle1AH及相應免疫蛋白的關(guān)系,并從蛋白層面上對Tle1AH功能開展深入研究,以期更進一步闡明Tle1AH在嗜水氣單胞菌生存及致病過程中的作用。