潘波,姜蕾,王冰潔,林勇

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物病蟲(chóng)害綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 ?？?571101)

草甘膦(glyphosate)是一種高效、低毒、廣譜、內(nèi)吸傳導(dǎo)型廣譜滅生性除草劑,對(duì)多年生深根性雜草地下組織有很強(qiáng)的破壞能力,在抑制農(nóng)地雜草、保護(hù)農(nóng)作物生長(zhǎng)方面發(fā)揮了巨大的作用,是我國(guó)乃至世界生產(chǎn)量和使用量最大的除草劑[1-2]。隨著草甘膦的大量使用,較多草甘膦進(jìn)入土壤和水中,土壤中的草甘膦雖然易與土壤中的膠體等顆粒物結(jié)合[3],但是由于草甘膦與磷酸鹽具有相似的吸附機(jī)制[4],在土壤吸附位點(diǎn)相互競(jìng)爭(zhēng)[5],在磷肥使用飽和的地區(qū),進(jìn)入土壤的草甘膦易發(fā)生解吸,再加上草甘膦具有較高的水溶性以及在環(huán)境中有較長(zhǎng)的半衰期(從幾周到幾年不等,平均為2個(gè)月),使草甘膦在施藥較長(zhǎng)時(shí)間后或者在遠(yuǎn)離施藥點(diǎn)的地方均能檢測(cè)到[6-7]。大量報(bào)道顯示,草甘膦及其主要代謝產(chǎn)物氨甲基膦酸(aminomethyl phosphonic acid,AMPA)在農(nóng)業(yè)土壤、沉積物及水體中均經(jīng)常檢出[8-9],其對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康具有潛在危害[10-11],對(duì)人體、動(dòng)物和微生物均有一定的毒性[12-14]。因此,建立一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)水中草甘膦及其降解產(chǎn)物方法,實(shí)現(xiàn)水體污染的及時(shí)監(jiān)測(cè)和快速應(yīng)對(duì),以避免水體污染進(jìn)一步通過(guò)食物鏈傳遞造成人類(lèi)健康和生態(tài)環(huán)境的危害十分必要。不衍生直接進(jìn)樣法操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、高效,可滿(mǎn)足環(huán)境水樣檢測(cè)、監(jiān)測(cè)的需求,然而,目前關(guān)于水樣中草甘膦及氨甲基膦酸的直接進(jìn)樣法均采用正相色譜法[15],不適合雜質(zhì)較多的環(huán)境水樣,而基于柱效高、分離能力強(qiáng)且溶劑選擇性更廣的反相色譜柱的不衍生直接進(jìn)樣法更具有實(shí)際意義。

由于草甘膦和氨甲基膦酸較難揮發(fā),能溶于水,不含發(fā)色和熒光官能團(tuán),其提取、濃縮、檢測(cè)難度比較大。同時(shí),2種物質(zhì)都具有強(qiáng)極性又導(dǎo)致其很難在一般的C18色譜柱上進(jìn)行分離和保留,進(jìn)一步增加了檢測(cè)難度。所以,目前在多種基質(zhì)包括水體[16]、土壤[17]、茶葉[18-19]等植物源食品[20]和動(dòng)物源食品[21]中草甘膦和氨甲基膦酸的殘留檢測(cè)普遍要先通過(guò)柱前衍生再進(jìn)行檢測(cè)。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[22]中使用柱前衍生液相色譜熒光檢測(cè)器檢測(cè)土壤和沉積物中草甘膦的殘留,但此種方法檢出限較高。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[23]中使用氣相色譜質(zhì)譜法檢測(cè)植物性產(chǎn)品中草甘膦的殘留,此種方法衍生步驟較為繁瑣,且衍生條件難以控制。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[24]中規(guī)定使用9-芴基甲基三氯甲烷將草甘膦和氨甲基膦酸衍生后再由液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè),該方法是目前最常用的方法,但是,此法需要復(fù)雜的衍生步驟,國(guó)標(biāo)中規(guī)定要衍生過(guò)夜,耗時(shí)長(zhǎng),無(wú)法滿(mǎn)足快速檢測(cè)、監(jiān)測(cè)的需求。

本研究通過(guò)對(duì)色譜條件和前處理方法等條件的篩選,建立基于反相色譜法的不衍生直接進(jìn)樣檢測(cè)水中草甘膦和氨甲基膦酸的方法。鑒于目前沒(méi)有針對(duì)水樣中草甘膦和氨甲基膦酸檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),故本研究又對(duì)關(guān)于其他介質(zhì)中草甘膦和氨甲基膦酸檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中所涉及的柱前衍生-液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)法進(jìn)行了優(yōu)化,進(jìn)而對(duì)2種方法進(jìn)行系統(tǒng)比較,為水環(huán)境中草甘膦和氨甲基膦酸的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)提供科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC I-class型超高效液相色譜;XEVO TQ-MS型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀;色譜柱:Waters BEH C18(100 mm×2.1mm,1.7 μm)、Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);固相萃取小柱:C18(500 mg 6cc)、HLB(200 mg 6cc)。以上均購(gòu)于美國(guó)Waters。

甲醇、乙腈、甲酸(色譜純,美國(guó)Fisher);丙酮、硼酸鈉、無(wú)水乙酸銨(分析純,廣東化學(xué)試劑廠);9-芴基甲基三氯甲烷(99.0%,美國(guó)Sigma);草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品(98.6%,德國(guó)DR);氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)品(99.9%,德國(guó)DR);試驗(yàn)用水均為超純水系統(tǒng)制備。

1.2 溶液的配制

草甘膦、氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.0 mg·mL-1):分別精確稱(chēng)取50.0 mg(±0.1 mg)的草甘膦、氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)品于聚乙烯塑料瓶中,分別加入49.3 g(±0.1 mg)、50.0 g(±0.1 mg)超純水,加入100 μL鹽酸,充分搖勻并使其全部溶解,低于5 ℃保存,有效期為1年。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制(1.0 mg·L-1):分別取10 μL草甘膦、氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中,并用超純水定容至刻度線(xiàn)。

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用空白水樣逐步稀釋,得到草甘膦和氨甲基膦酸質(zhì)量濃度分別為0.5、2、10、50、200 μg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

衍生試劑(9-芴基甲基三氯甲烷的丙酮溶液,1.0 g·L-1)的配制:稱(chēng)取100.0 mg 9-芴基甲基三氯甲烷用丙酮溶解并定容至100 mL。

50 g·L-1硼酸鈉緩沖溶液的配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g硼酸鈉(Na2B4O7·10H2O),用水溶解并定容至100 mL。

1.3 水樣預(yù)處理

直接進(jìn)樣法:取1 mL樣品過(guò)0.22 μm水系濾膜后直接進(jìn)樣測(cè)定。

柱前衍生法:取1 mL樣品于5 mL離心管中,加入200 μL 50 g·L-1硼酸鈉緩沖溶液,混勻后加入200 μL衍生試劑,再次混勻,衍生4 h以上,系列標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液按以上步驟進(jìn)行衍生,過(guò)0.22 μm水系濾膜,待測(cè)。

1.4 儀器的檢測(cè)條件

1.4.1 直接進(jìn)樣法色譜條件色譜柱:Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱溫:室溫;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為16 mmol·L-1的氨水。液相條件見(jiàn)表1。

表1 直接進(jìn)樣法和柱前衍生法梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI),負(fù)離子模式多反應(yīng)檢測(cè)模式,離子源溫度150 ℃,去溶劑溫度為 450 ℃,去溶劑氣流量1 000 L·h-1,毛細(xì)管電壓2.4 kV。質(zhì)譜多反應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)(MRM)參數(shù):草甘膦定量離子對(duì)為168.0/80.9,錐孔電壓30 V,碰撞電壓14 V;定性離子對(duì)為168.0/62.9,錐孔電壓30 V,碰撞電壓11 V。氨甲基膦酸定量離子對(duì)為109.9/62.9,錐孔電壓30 V,碰撞電壓15 V;定性離子對(duì)為109.9/79.9,錐孔電壓30 V,碰撞電壓12 V。

1.4.2 柱前衍生法色譜條件色譜柱:Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱溫:室溫;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為10 mmol·L-1乙酸銨(含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸)的水溶液。液相條件見(jiàn)表1。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI),正離子模式多反應(yīng)檢測(cè)模式,離子源溫度150 ℃,去溶劑溫度為450 ℃,去溶劑氣流量1 000 L·h-1,毛細(xì)管電壓2.4 kV。MRM參數(shù):草甘膦衍生產(chǎn)物定量離子對(duì)為392.0/170.1,錐孔電壓25 V,碰撞電壓12 V;定性離子對(duì)為392.0/214.1,錐孔電壓25 V,碰撞電壓12 V。氨甲基膦酸定量離子對(duì)為334.1/179.1,錐孔電壓23 V,碰撞電壓10 V;定性離子對(duì)為334.1/156.0,錐孔電壓23 V,碰撞電壓10 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

直接進(jìn)樣法:根據(jù)草甘膦及氨甲基膦酸的分子結(jié)構(gòu)特征,質(zhì)譜離子源選擇負(fù)離子電離模式,取1 mg·L-1的草甘膦和氨甲基膦酸的混合標(biāo)準(zhǔn)液,以20 μL·min-1的流速進(jìn)入質(zhì)譜,調(diào)節(jié)質(zhì)譜的錐孔電壓、碰撞電壓等參數(shù),找到草甘膦和氨甲基膦酸的特征母離子分別為168.0和109.9。逐漸加大碰撞能量,找到信號(hào)強(qiáng)度最好的2個(gè)子離子作為定量和定性離子,草甘膦定量和定性離子對(duì)分別為168.0/80.9和168.0/62.9,氨甲基膦酸定量和定性離子對(duì)分別為109.9/62.9和109.9/79.9。

柱前衍生法:對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生液進(jìn)行ESI離子源正模式下全掃描,選擇豐度較高的2個(gè)離子碎片作為定量和定性離子。草甘膦與氨甲基膦酸衍生產(chǎn)物母離子分別為392.0和334.1,草甘膦的定量和定性子離子對(duì)分別為392.0/170.1和392.0/214.1,氨甲基膦酸的定量和定性離子對(duì)分別為334.1/179.1和334.1/156.0。比行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[24]中規(guī)定草甘膦的定量和定性離子對(duì)(392.0/88.0和392.0/214.0)與氨甲基膦酸的定量和定性離子對(duì)(334.0/179.1和334.0/112.0)靈敏度都高。

2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

為了使檢測(cè)物質(zhì)有更好的儀器響應(yīng)和色譜分離效果,對(duì)2種檢測(cè)方法進(jìn)行流動(dòng)相的優(yōu)化。

直接進(jìn)樣法:分別比較乙腈-16 mmol·L-1氨水、乙腈-27 mmol·L-1氨水、乙腈-10 mmol·L-1乙酸銨、乙腈-水、甲醇-16 mmol·L-1氨水、甲醇-27 mmol·L-1氨水、甲醇-10 mmol·L-1乙酸銨、甲醇-水共8種流動(dòng)相的洗脫分離效果。結(jié)果(圖1)顯示:在乙腈-10 mmol·L-1乙酸銨和甲醇-10 mmol·L-1乙酸銨2個(gè)流動(dòng)相下,2種檢測(cè)物質(zhì)均基本沒(méi)有信號(hào);流動(dòng)相甲醇-水也基本沒(méi)有信號(hào),乙腈-水信號(hào)較弱且物質(zhì)拖尾嚴(yán)重;乙腈-27 mmol·L-1氨水、甲醇-27 mmol·L-1氨水這2個(gè)流動(dòng)相下,2種檢測(cè)物質(zhì)響應(yīng)信號(hào)較弱;乙腈-16 mmol·L-1氨水和甲醇-16 mmol·L-1氨水2個(gè)流動(dòng)相的2種物質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度最好且峰型對(duì)稱(chēng),考慮到乙腈擁有更強(qiáng)的洗脫能力,能減少分析時(shí)間,故選擇乙腈-16 mmol·L-1氨水作為直接測(cè)定法流動(dòng)相。使用直接進(jìn)樣法時(shí)發(fā)現(xiàn),由于草甘膦及其代謝產(chǎn)物氨甲基膦酸水溶性較強(qiáng),極性較大且分子質(zhì)量較小,一般的C18色譜柱很難對(duì)其進(jìn)行保留,本試驗(yàn)選擇HSS T3色譜柱,其固定相是能與100%水流動(dòng)相兼容的C18,增強(qiáng)了其對(duì)這2種極性物質(zhì)的保留。

柱前衍生法:分別比較乙腈-水和乙腈-10 mmol·L-1乙酸銨2種流動(dòng)相的洗脫分離效果。結(jié)果(圖2)顯示:2種檢測(cè)物質(zhì)的衍生產(chǎn)物在乙腈-水流動(dòng)相體系下,在色譜柱的保留分離較差,拖尾嚴(yán)重,峰形不好且信號(hào)較低。在乙腈-10 mmol·L-1乙酸銨流動(dòng)相下,2種衍生產(chǎn)物有比較好的響應(yīng)信號(hào),而在流動(dòng)相中加入甲酸能增加離子化效率,故選擇乙腈-10 mmol·L-1乙酸銨(含體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸)作為柱前衍生法流動(dòng)相。

2.3 前處理的優(yōu)化

行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[22,24]中前處理是針對(duì)土壤、沉積物、食品等比較復(fù)雜的基質(zhì)樣品,并不適合水樣品的檢測(cè),所以對(duì)水樣品的前處理進(jìn)行了優(yōu)化。

2.3.1 固相萃取小柱的選擇選擇具有代表性的2種小柱進(jìn)行比較,一種是C18小柱,樣品富集在小柱上,然后再進(jìn)行洗脫;一種是HLB小柱,樣品直接通過(guò)小柱,雜質(zhì)吸附小柱中,目標(biāo)物直接被洗脫。取空白水樣加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液使水樣中草甘膦和氨甲基膦酸的質(zhì)量濃度為100 μg·L-1,分別比較直接進(jìn)樣、C18小柱凈化和HLB小柱凈化3種凈化方法的回收率,結(jié)果(表2)顯示:直接進(jìn)樣法的草甘膦回收率為94.00%(C18)～96.71%(直接進(jìn)樣),氨甲基膦酸回收率為94.95%(HLB)～102.43%(C18);柱前衍生法:草甘膦回收率為95.95%(HLB)～110.31%(直接進(jìn)樣),氨甲基膦酸回收率為96.15%(HLB)～100.43%(直接進(jìn)樣),3種凈化方法的回收率均能滿(mǎn)足殘留檢測(cè)的要求。直接進(jìn)樣2種物質(zhì)的回收率相對(duì)較高,考慮到節(jié)約成本和操作方便,在樣品雜質(zhì)干擾較少的情況下可直接進(jìn)樣,效率更高;樣品雜質(zhì)較多時(shí),可采用固相萃取去除雜質(zhì),HLB小柱較C18小柱省去了洗脫的步驟,且更省時(shí)。我們建立的不衍生直接進(jìn)樣法既不需要復(fù)雜的前處理,又不需要長(zhǎng)時(shí)間的衍生步驟,再加上所使用的超高效液相系統(tǒng),提高了分析效率。使用CAX陽(yáng)離子交換柱[24],其凈化步驟更為繁瑣,且價(jià)格較高。柱前衍生法需要向樣品中引入高濃度的衍生試劑。有文獻(xiàn)報(bào)道[25]使用柱前衍生-熒光檢測(cè)器檢測(cè)時(shí),會(huì)出現(xiàn)信號(hào)很強(qiáng)的衍生試劑峰,但對(duì)樣品峰并沒(méi)有顯著影響,可能會(huì)對(duì)色譜柱壽命及質(zhì)譜系統(tǒng)產(chǎn)生一定影響。有研究[26-27]顯示衍生后過(guò)C18小柱凈化,能有效去除衍生試劑,改善了峰形,減少衍生試劑對(duì)色譜系統(tǒng)的損害。

表2 不同凈化方式對(duì)水中草甘膦和AMPA回收率的影響

2.3.2 濾膜的選擇由于柱前衍生法向樣品加入的衍生試劑含有丙酮,故比較水系和有機(jī)系2種濾膜對(duì)回收率的影響。由表3可知:2種物質(zhì)通過(guò)2種濾膜的回收率無(wú)顯著差異,可能由于有機(jī)溶劑含量較低,對(duì)水系濾膜影響較小。由于水比較難浸潤(rùn)有機(jī)系濾膜,且水系濾膜相對(duì)經(jīng)濟(jì),所以選擇水系濾膜。

表3 不同濾膜對(duì)水中草甘膦和AMPA回收率的影響

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與最低檢出限

取1.2節(jié)中系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)0.22 μm水系濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣測(cè)定;柱前衍生法按1.3節(jié)中方法衍生后經(jīng)0.22 μm水系濾膜過(guò)濾后測(cè)定,色譜圖見(jiàn)圖3和圖4。以峰面積(y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),并計(jì)算線(xiàn)性方程和相關(guān)系數(shù),按3倍信噪比作為方法的檢出限,以10倍信噪比作為方法的定量限。結(jié)果(表4)顯示:直接進(jìn)樣法和柱前衍生法檢測(cè)水中草甘膦和氨甲基膦酸在0.5～200 μg·L-1線(xiàn)性關(guān)系均良好,直接進(jìn)樣法草甘膦和氨甲基膦酸檢出限分別為0.104和0.072 μg·L-1,定量限分別為0.348和0.241 μg·L-1;柱前衍生法草甘膦和氨甲基膦酸檢出限分別為0.019和0.024 μg·L-1,定量限分別為0.063和0.078 μg·L-1。2種方法都能達(dá)到殘留檢測(cè)的分析要求,柱前衍生法具有更高的靈敏度,而直接進(jìn)樣法靈敏度稍低,但能夠省去復(fù)雜的衍生步驟,方便快捷。有研究者使用柱前衍生液相色譜熒光檢測(cè)器檢測(cè)草甘膦及氨甲基膦酸[16,25],檢出限0.002～0.009 mg·L-1,均高于本文建立的2種方法的檢出限。

表4 草甘膦和AMPA的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、最低檢出限和定量限

2.5 方法的回收率和精密度

2.5.1 方法的回收率在空白水樣中進(jìn)行1、5、10、50、100 μg·L-15個(gè)質(zhì)量濃度的添加回收,每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3次。結(jié)果(表5)顯示:直接進(jìn)樣法草甘膦的回收率為90.93%～111.24%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.18%～16.52%,氨甲基膦酸的回收率為81.98%～93.11%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.46%～10.27%。柱前衍生法草甘膦的回收率為86.37%～110.32%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.72%～8.44%,氨甲基膦酸的回收率為85.56%～100.43%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.44%～6.54%。2種方法的回收率均能滿(mǎn)足殘留檢測(cè)要求。

表5 直接進(jìn)樣法和柱前衍生法草甘膦和AMPA的回收率

2.5.2 方法的精密度按試驗(yàn)方法對(duì)50、100 μg·L-1草甘膦和氨甲基膦酸的混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行檢測(cè),重復(fù)測(cè)定6次,計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。直接進(jìn)樣法2種物質(zhì)峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.81%～2.27%,柱前衍生法2種物質(zhì)峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.07%～2.58%,表明方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性較好,方法能滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求。

3 小結(jié)

本文建立了更適合環(huán)境水樣檢測(cè)的基于反相色譜法的不衍生直接通過(guò)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)水中草甘膦和氨甲基膦酸的方法,并對(duì)柱前衍生后液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)水中草甘膦和氨甲基膦酸的方法進(jìn)行了優(yōu)化,進(jìn)而對(duì)2種方法進(jìn)行系統(tǒng)的比較。結(jié)果表明:2種方法均能滿(mǎn)足水中草甘膦和氨甲基膦酸的定量檢測(cè)要求。柱前衍生法具有更好的靈敏度,但是需要復(fù)雜的衍生步驟,且衍生時(shí)間需4 h以上。而直接進(jìn)樣法靈敏度稍低,但能夠省去衍生步驟,易于操作,方便快捷。所以在對(duì)水中殘留草甘膦及其降解產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)時(shí),應(yīng)根據(jù)檢測(cè)需要對(duì)方法進(jìn)行選擇。