宮宇,毛卓卓,史貴霞,楊中義,喻德躍,黃方

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

大豆是一種重要的蛋白質(zhì)來(lái)源,是人類生活中很重要的食物及營(yíng)養(yǎng)來(lái)源之一。目前對(duì)蛋白質(zhì)的合成過(guò)程即轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)的研究有較大進(jìn)步,但是對(duì)蛋白降解途徑研究較少[1]。真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)的降解途徑主要包括溶酶體途徑、泛素蛋白酶體途徑和胱天蛋白酶途徑3種。其中泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)是最有效的特異降解蛋白質(zhì)的途徑之一[2],而E3連接酶是該過(guò)程中泛素分子對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性識(shí)別最關(guān)鍵的一類酶[3],負(fù)責(zé)識(shí)別特定靶標(biāo)蛋白的賴氨酸,將泛素轉(zhuǎn)移到底物蛋白并使之泛素化降解[4],從而在植物調(diào)控激素水平、生長(zhǎng)發(fā)育以及抵抗非生物脅迫等過(guò)程中起重要作用[5-7]。例如水稻E3泛素連接酶基因OsDSG1的T-DNA插入突變體不僅延遲種子萌發(fā)、增強(qiáng)對(duì)高鹽和干旱脅迫的耐受性,而且在osdsg1突變體中,ABA 信號(hào)途徑基因和ABA 響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高[8]。

E3泛素連接酶主要分為3大類:HECT結(jié)構(gòu)域家族、RING結(jié)構(gòu)域家族及U-box蛋白家族[9]。其中,U-box 域是植物特有的一類高度保守的功能結(jié)構(gòu)域,由70多個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成[10]。U-box結(jié)構(gòu)保守氨基酸的突變或替換都能導(dǎo)致 E3 泛素連接酶活性的喪失從而抑制泛素化。因而U-box 蛋白在UPP中扮演著至關(guān)重要的角色[11]。擬南芥中有63個(gè)U-box蛋白成員,在水稻基因組中鑒定出77個(gè)含有U-box結(jié)構(gòu)的蛋白[12],在大豆基因組中鑒定出128個(gè)U-box基因[13]。已有研究表明,植物U-box型E3泛素連接酶參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物及非生物脅迫響應(yīng)等過(guò)程。如擬南芥PUB30基因可調(diào)控植物耐鹽作用并受鹽脅迫誘導(dǎo),BKI1是PUB30發(fā)揮耐鹽功能的靶標(biāo),其通過(guò)促進(jìn)BKI1的降解負(fù)調(diào)控耐鹽性,pub30突變體種子在萌發(fā)時(shí)對(duì)鹽脅迫更具耐受性[14]。水稻編碼U-box的 E3泛素連接酶基因OsPUB67受干旱、鹽、冷、JA和ABA顯著誘導(dǎo)且以ABA依賴性方式參與調(diào)控與非生物脅迫響應(yīng)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的基因[15]。Wang等[13]發(fā)現(xiàn),與野生型相比,過(guò)表達(dá)GmPUB8的擬南芥種子在萌發(fā)和發(fā)芽后的生長(zhǎng)對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性降低,植株葉片數(shù)量減少且GmPUB8以光周期依賴性方式調(diào)節(jié)開(kāi)花時(shí)間。目前植物U-box型E3泛素連接酶的鑒定及功能研究已取得較大進(jìn)展,但大豆中的報(bào)道只有極少數(shù)[13,16]。

Shi等[17]通過(guò)RNA-seq測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組分析,篩選出‘南農(nóng)94-16’與其突變體(cco)2個(gè)樣本之間的差異表達(dá)基因,并利用半定量RT-PCR對(duì)15個(gè)差異表達(dá)基因在‘南農(nóng)94-16’和cco突變體開(kāi)花后7 d的莢中進(jìn)行驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上,本研究挑選1個(gè)半定量RT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致的E3泛素連接酶基因GmPUB1,對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。同時(shí)利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)其在大豆不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期、不同組織部位的表達(dá)量以及各種非生物脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式進(jìn)行分析。對(duì)過(guò)表達(dá)擬南芥表型以及種子中氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定并進(jìn)行逆境脅迫下(ABA、PEG、NaCl)擬南芥種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)。初步證明GmPUB1基因?qū)χ参镯憫?yīng)逆境脅迫以及種子生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株及試劑

大豆品種‘南農(nóng)94-16’由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心種質(zhì)資源庫(kù)提供,大豆子葉折疊突變體cco由本實(shí)驗(yàn)室韓鎖義博士通過(guò)EMS、NaN3-60Cor自然誘變大豆栽培品種‘南農(nóng)94-16’而得,材料種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦實(shí)驗(yàn)場(chǎng)。出苗后1個(gè)月左右,分別取‘南農(nóng)94-16’及突變體cco的根、莖、葉、花;之后掛牌分別取開(kāi)花后7、10、15、30和40 d的種子,立即置于液氮中,再于超低溫冰箱保存待用。

采用擬南芥Columbia-0生態(tài)型種子作為供試材料,由本實(shí)驗(yàn)室提供。

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京天根生化科技有限公司。根癌農(nóng)桿菌EHA105及植物表達(dá)載體pMDC83由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心保存。連接載體pMD19-T克隆載體試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自英駿生物技術(shù)有限公司。凝膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司。Taq聚合酶和DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自全式金公司?？敲顾?Kan)、潮霉素B(HygB)、利福平(Rif)等購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.2 GmPUB1基因的克隆

使用北京天根生化科技公司的RNA Total RNA Kit(離心柱型)DP419試劑盒提取大豆幼嫩葉片的RNA,將提取的RNA利用Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒(保存于-20 ℃)進(jìn)行cDNA第1鏈的合成,所用的移液器Tips及PCR管無(wú)RNase。利用Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)得到其完整的基因序列,以大豆嫩葉的cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物:GmPUB1F1:5′-ATGTAGCACAAAGCAGGTAGT-3′,GmPUB1R1:5′-AGGTCCGTATGTCTCAAATCTA-3′。

PCR產(chǎn)物在加入5 μL 10×loading buffer后,用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),將分離出的目的條帶進(jìn)行切膠、純化后檢測(cè)濃度。膠回收產(chǎn)物首先用Taq酶加A尾,取適量與pMD19-T Vector 4 ℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,涂布帶有抗性的平板,培養(yǎng)后挑取單克隆。PCR鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的菌液進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,從而獲得基因完整的序列信息。保存菌液以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3 GmPUB1基因的生物信息學(xué)分析

通過(guò)Phytozome網(wǎng)站(http://www.phytozome.net/soybean),下載基因的CDS序列、氨基酸序列及其部分同源基因的蛋白序列,用軟件BioXM 2.6預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量和等電點(diǎn),用Clustal X2.0進(jìn)行多序列同源對(duì)比,利用MEGA 5軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析,通過(guò)TargetP軟件預(yù)測(cè)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。

1.4 GmPUB1基因在不同組織中以及在不同脅迫處理下的表達(dá)分析

分別取突變體cco和‘南農(nóng)94-16’不同發(fā)育時(shí)期的組織器官,提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板,進(jìn)行qRT-PCR分析。根據(jù)大豆基因組Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中該基因的CDS序列,利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物,GmPUB1F2:5′-AATATTTGAAGGCATGGGTCTTG-3′,GmPUB1R2:5′-TGGTGTTGTCACTGCGAACA-3′。以大豆組成型表達(dá)基因Tubulin(GenBank No.:AY907703)作為內(nèi)參,其引物序列為:GmtubullinF:5′-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3′,GmtubullinR:5′-CACTTACGCATCACAT-AGCA-3′。使用Bio-Rad iQ5 real-time PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR,采用SYBR?Green Real-time PCR Master Mix(Toyobo QPK-201,Japan)試劑。反應(yīng)體系:Real-time PCR Master Mix 25 μL,cDNA模板5 μL,上、下游引物各1 μL,補(bǔ)滅菌ddH2O至50 μL。PCR程序:95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸45 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線以及熔解曲線。

大豆幼苗的非生物脅迫和激素處理:將長(zhǎng)勢(shì)一致的大豆‘Williams 82’幼苗置于1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中預(yù)處理 3 d,之后進(jìn)行不同處理。干旱處理:將幼苗轉(zhuǎn)移到15%的PEG3350水溶液中分別處理0、0.5、2 h;冷脅迫處理:將幼苗置于4 ℃分別處理2、4 h;鹽、JA和ABA處理:將幼苗分別轉(zhuǎn)移至250 mmol·L-1NaCl、50 mol·L-1JA和100 μmol·L-1ABA脅迫誘導(dǎo)3、6 h。對(duì)照材料置于水中分別處理 0、0.5、2、3、4和 6 h。所有處理分別采集植株葉片立即液氮冷凍,-80 ℃保存,供RNA提取使用。以大豆‘Williams 82’經(jīng)過(guò)非生物脅迫以及激素處理后的葉片cDNA為模板,以大豆組成型表達(dá)基因Tubulin為內(nèi)參,進(jìn)行qRT-PCR分析。目的基因的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算基于2-ΔΔCT法。

1.5 GmPUB1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建

利用上游引物GmPUB1F3:5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGTTTTGTCATGGA-CAAA-3′和下游引物GmPUB1R3:5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGAAGGGCTTCTTCAAA-TGCT-3′,以測(cè)序正確的連接有GmPUB1全長(zhǎng)cDNA的pMD19-T載體質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增GmPUBP1基因的CDS序列。用Gateway系統(tǒng)的BP反應(yīng)將大豆GmPUB1基因CDS序列構(gòu)建到入門載體pDONRTM221上,將得到的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌并測(cè)序,得到正確的序列后,提取質(zhì)粒進(jìn)行LR反應(yīng),經(jīng)過(guò)重組交換使目的片段連接到表達(dá)載體pMDC83中,得到由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的含有目的基因的表達(dá)載體pMDC83-GmPUB1。菌液經(jīng)過(guò)PCR及酶切鑒定后,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞,挑取單克隆,培養(yǎng)后PCR檢測(cè)條帶大小正確無(wú)誤后,一部分菌液-80 ℃保存?zhèn)溆?一部分提取質(zhì)粒,存放于-20 ℃待用。

1.6 GmPUB1蛋白亞細(xì)胞定位分析

將新鮮的洋蔥內(nèi)表皮緊密貼合在MS固體培養(yǎng)基平板上,黑暗培養(yǎng)過(guò)夜。以測(cè)序正確的連接有全長(zhǎng)GmPUB1cDNA的載體質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增GmPUB1基因的開(kāi)放閱讀框(ORF),將ORF與GFP報(bào)告基因融合,形成1個(gè)GmPUB1-GFP的嵌合基因。質(zhì)粒包裹好金粉后利用基因槍法打入洋蔥表皮細(xì)胞中,基因槍轟擊后的洋蔥表皮在室溫暗環(huán)境下培養(yǎng)1 d后,利用Leica TCS SP2激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察GFP報(bào)告基因的定位情況。

1.7 蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥

將含有重組載體pMDC83-GmPUB1質(zhì)粒的陽(yáng)性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌株劃線培養(yǎng)24 h后,接種于含有Kan、HygB、Rif的 YEB液體培養(yǎng)基中,28 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng),當(dāng)D600值達(dá)到0.8～1.0后,離心收集菌液,加入含有0.3%表面活性劑Silwet的蔗糖溶液至D600=0.8左右。于擬南芥開(kāi)花期,利用蘸花法將構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體pMDC83-GmPUB1轉(zhuǎn)化野生型擬南芥,農(nóng)桿菌侵染當(dāng)代的植株為T0代。

1.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥抗性篩選及陽(yáng)性苗鑒定

將收獲的T0代種子放入2 mL離心管中,用70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇浸泡1 min,30% H2O2浸泡10 min,于超凈臺(tái)內(nèi)用滅菌水清洗干凈后,均勻種植于固體MS培養(yǎng)基(含50 mg·L-1Hyg B)上,置于人工智能培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 d左右。植株生長(zhǎng)正常的幼苗初步認(rèn)為陽(yáng)性T1代植株。提取轉(zhuǎn)基因擬南芥及對(duì)照野生型擬南芥植株的DNA。取1 μL DNA為模板,以構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體時(shí)的引物(GmPUB1F3和GmPUB1R3)進(jìn)行PCR鑒定。設(shè)置含有GmPUB1基因CDS的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照,野生型擬南芥的DNA為陰性對(duì)照。T1代植株單株收獲,繼續(xù)種于含有HygB抗性的平板上篩選至T3代。

以T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型葉片cDNA為模板,擬南芥組成型表達(dá)基因Tubulin(GenBank ID:AT5G62690)為內(nèi)參,檢測(cè)GmPUB1基因表達(dá)情況。

1.9 轉(zhuǎn)基因擬南芥千粒質(zhì)量和氨基酸含量測(cè)定

待T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥成熟后,將種子放入2 mL離心管中,置于30 ℃烘箱中烘1周以上,而后進(jìn)行轉(zhuǎn)基因種子千粒質(zhì)量和氨基酸含量的測(cè)定。稱取至少0.12 g的擬南芥種子于液氮中研磨后加入5 mL HCl浸提液過(guò)濾后定容至10 mL;加入4%(體積分?jǐn)?shù))磺基水楊酸,15 000 r·min-1離心15 min,取上清液,于氨基酸分析儀(L-8900)測(cè)定氨基酸含量。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.10 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在不同脅迫處理下的萌發(fā)率

選取3個(gè)株系的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型種子,用70%乙醇浸泡1 min,30%H2O2浸泡10 min,于超凈臺(tái)內(nèi)用滅菌水清洗干凈后,在含有70 mmol·L-1NaCl、6%PEG和0.1 μmol·L-1ABA的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行非生物脅迫,重復(fù)3次,7 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmPUB1基因cDNA全長(zhǎng)的克隆

以‘南農(nóng)94-16’嫩葉的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到長(zhǎng)度為1 320 bp的DNA片段。測(cè)序結(jié)果與Phytozome中大豆Glyma.14g212200的CDS序列完全一致,即目的基因克隆成功,將該基因命名為GmPUB1(圖1)。

2.2 GmPUB1基因的生物信息學(xué)分析

ExPASy proteomics 網(wǎng)站分析表明,GmPUB1基因編碼439個(gè)氨基酸,GmPUB1蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為48.63×103,等電點(diǎn)為8.35。將GmPUB1蛋白氨基酸序列與其他植物 U-box 同源蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)在保守結(jié)構(gòu)域高度相似(圖2)。將擬南芥、苜蓿、水稻、玉米和菜豆中的U-box蛋白與GmPUB1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),結(jié)果(圖3)顯示,GmPUB1與擬南芥的AT1G66160、菜豆的Phvul.008G238500、苜蓿的Medtr5g077510同源,與菜豆中的Phvul.008G238500和大豆中的Glyma.02G242900聚為一枝,表明他們的親緣關(guān)系最近。

2.3 GmPUB1基因在不同組織以及不同脅迫處理下的表達(dá)分析

從圖4可見(jiàn):GmPUB1在大豆各個(gè)組織中都有表達(dá),但是在對(duì)照野生型和cco突變體中表達(dá)量不一致,在cco突變體開(kāi)花后40 d的種子中表達(dá)量顯著高于野生型,這與前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相符[17]。而且在種子后熟期GmPUB1的表達(dá)量較高,在開(kāi)花后30 d的種子中表達(dá)量最高,說(shuō)明GmPUB1基因可能在種子發(fā)育后期發(fā)揮作用。

在PEG3350處理0.5 h時(shí)GmPUB1表達(dá)量極顯著高于其他時(shí)間(圖5-A)。在低溫處理2和4 h,GmPUB1表達(dá)量均顯著升高(圖5-B)。在NaCl處理3 h時(shí),GmPUB1表達(dá)量最大,隨后下降;GmPUB1基因表達(dá)量在JA處理3和 6 h上升;ABA脅迫處理3 h時(shí),GmPUB1表達(dá)量顯著降低,之后表達(dá)量回升(圖5-C)。以上結(jié)果表明,GmPUB1基因表達(dá)量受PEG、NaCl和低溫的誘導(dǎo),但在ABA處理時(shí)表達(dá)量降低。推測(cè)該基因可能參與了大豆響應(yīng)非生物脅迫的調(diào)控過(guò)程。

2.4 GmPUB1蛋白的亞細(xì)胞定位分析

從圖6可見(jiàn):pMDC83-GFP綠色熒光分布在整個(gè)洋蔥表皮細(xì)胞中(圖6-A),轉(zhuǎn)入pMDC83-GmPUB1-GFP的洋蔥表皮細(xì)胞中也均有綠色熒光蛋白的存在(圖6-B)。表明GmPUB1融合蛋白在整個(gè)細(xì)胞中都有表達(dá)。

2.5 轉(zhuǎn)GmPUB1基因擬南芥陽(yáng)性植株的PCR檢測(cè)

提取8株具有潮霉素抗性的T1代GmPUB1轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型的葉片DNA進(jìn)行PCR檢測(cè),以目的基因GmPUB1上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以pMDC83-GmPUB1重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照,以野生型擬南芥DNA及滅菌水作為陰性對(duì)照。結(jié)果如圖7所示,陰性對(duì)照沒(méi)有條帶,陽(yáng)性對(duì)照及轉(zhuǎn)基因植株中有1條 1 320 bp的條帶,說(shuō)明外源GmPUB1已經(jīng)成功插入到擬南芥的基因組中。

提取T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥RNA,進(jìn)行熒光定量分析,檢測(cè)GmPUB1在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果如圖8所示,不同轉(zhuǎn)基因株系中均有GmPUB1基因的表達(dá)。

2.6 GmPUB1過(guò)表達(dá)擬南芥千粒質(zhì)量和氨基酸含量變化

GmPUB1轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代表型與野生型相比并無(wú)明顯變化。表達(dá)量較高的3個(gè)株系OE-4、OE-5、OE-6的千粒質(zhì)量比野生型顯著提高(圖9),且3個(gè)株系氨基酸含量發(fā)生改變,尤其是甲硫氨酸含量顯著提高(圖10),表明異源表達(dá)GmPUB1對(duì)擬南芥種子的發(fā)育產(chǎn)生了一定的影響。

2.7 GmPUB1過(guò)表達(dá)擬南芥種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)

從圖11可見(jiàn):未進(jìn)行生物脅迫處理的GmPUB1轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)率顯著低于野生型(圖11-A)。在NaCl、PEG3350和ABA處理后,GmPUB1過(guò)表達(dá)株系和野生型的萌發(fā)率均顯著降低。NaCl處理后,3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)率與未處理時(shí)相比分別降低22.6%、24.0%和24.3%,野生型降低27.0%;PEG處理下,轉(zhuǎn)基因株系種子萌發(fā)率比未處理時(shí)分別降低7.8%、19.1%和23.1%,野生型降低7.2%;在ABA處理下,3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)率比未處理時(shí)分別降低8.4%、24.6%和10.7%,WT降低10.3%(圖11-B)。以上結(jié)果表明GmPUB1基因參與種子萌發(fā)進(jìn)程且過(guò)表達(dá)GmPUB1對(duì)干旱以及ABA處理更敏感,而對(duì)鹽處理更具耐受性。

3 討論

Shi等[17]對(duì)野生型(WT)和cco突變體7 d的莢進(jìn)行RNA-seq分析,發(fā)現(xiàn)WT和cco突變體中存在多個(gè)差異表達(dá)基因,其中GmPUB1基因在cco中的表達(dá)量顯著高于WT;通過(guò)半定量RT-PCR分析其在野生型和cco突變體7 d莢中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)GmPUB1基因在cco中的表達(dá)量高于WT。本研究對(duì)GmPUB1基因進(jìn)行進(jìn)一步的組織表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)該基因在突變體開(kāi)花后40 d的種子中表達(dá)量明顯高于對(duì)照,且在WT和cco的不同組織中存在差異表達(dá),這也進(jìn)一步驗(yàn)證了RNA-seq結(jié)果的準(zhǔn)確性。

U-box型E3泛素連接酶基因在逆境脅迫和激素應(yīng)答等方面起重要作用[18]。擬南芥AtPUB19基因過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致植株對(duì)ABA敏感性和抗旱性減弱,atpub19突變體的干旱脅迫標(biāo)記基因RAB18、ADH1、COR47、RD22和RD29A的表達(dá)量在干旱脅迫下顯著高于野生型,AtPUB19可能是依賴ABA信號(hào)途徑負(fù)調(diào)控植物抗旱性[19]。Park等[20]發(fā)現(xiàn)U-box型E3泛素連接酶基因OsPUB15在H2O2、鹽、干旱脅迫下,表達(dá)水平明顯升高,在高鹽條件下OsPUB15過(guò)表達(dá)植株長(zhǎng)勢(shì)比野生型好。本研究中GmPUB1基因?qū)Ω珊?、低溫、鹽以及JA和ABA處理均有響應(yīng),在NaCl、低溫、JA處理下呈極顯著上調(diào)趨勢(shì);在PEG3350處理下呈先上升再下降趨勢(shì);在ABA處理下,表達(dá)量極顯著下降。另外,NaCl、PEG和ABA處理后轉(zhuǎn)GmPUB1基因的擬南芥株系和WT種子萌發(fā)率都降低,但在NaCl處理時(shí),轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)率下降程度低于WT;而在PEG和ABA處理后,種子萌發(fā)率下降程度高于WT。綜上所述,大豆E3泛素連接酶基因GmPUB1可能參與逆境脅迫,并正調(diào)控鹽脅迫而負(fù)調(diào)控干旱脅迫,且可能通過(guò)ABA等激素途徑參與大豆非生物脅迫應(yīng)答,但具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

E3泛素連接酶基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用,包括參與花發(fā)育、植物衰老、種子萌發(fā)等。研究發(fā)現(xiàn),水稻E3連接酶基因OsPUB15是生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的正調(diào)控因子,OsPUB15的T-DNA插入突變引起水稻嚴(yán)重的生長(zhǎng)遲緩和幼苗致死表型,突變體種子不產(chǎn)生初生根,并且枝條發(fā)育顯著延遲[20]。Braumann等[21]發(fā)現(xiàn)半矮麥brh2和ari-l突變體由于缺失U-box E3泛素連接酶而發(fā)生矮化。擬南芥U-box蛋白基因PUB13參與調(diào)節(jié)擬南芥的花期,該基因T-DNA插入突變體后CO和FT基因上調(diào)表達(dá),抑制FLC基因表達(dá),突變體表現(xiàn)出在中長(zhǎng)日照條件下的早期開(kāi)花現(xiàn)象[22]。Shi等[17]的研究表明,突變體cco種子的百粒質(zhì)量和萌發(fā)率顯著低于對(duì)照,水解氨基酸含量顯著提高。由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因進(jìn)入植物細(xì)胞后能夠借助植物細(xì)胞的系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)制、整合和表達(dá),是與核DNA基因完全相同的穩(wěn)定表達(dá),遺傳穩(wěn)定性好[23],Bent[24]研究了通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥蘸花法獲得擬南芥株系后代,結(jié)果表明,其可以獲得大量穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系。因此,本研究選取了經(jīng)T3代檢測(cè)表達(dá)量較高的3個(gè)GmPUB1基因過(guò)表達(dá)擬南芥株系進(jìn)行表型觀察,發(fā)現(xiàn)GmPUB1基因過(guò)表達(dá)擬南芥植株種子的萌發(fā)率顯著降低。同時(shí),轉(zhuǎn)基因株系的千粒質(zhì)量極顯著提高,氨基酸含量發(fā)生改變。以上結(jié)果說(shuō)明該基因參與調(diào)控種子的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究結(jié)果對(duì)探索大豆U-box型E3泛素連接酶基因參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的調(diào)控作用具有一定的意義。